衰老及肥胖大鼠肝臟糖代謝相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)研究.pdf

1、人口老齡化是全球只趨面臨的挑戰(zhàn)，其中涉及到健康和疾病等問題。機(jī)體隨年齡增長(zhǎng)常伴隨肥胖，而衰老和肥胖又能夠引發(fā)2型糖尿病(Type2 diabetesmellitus，T2DM)等許多代謝性疾病。隨著近幾年代謝綜合征(Metabolicsyndrome，MS)研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)MS共同的病理生理基礎(chǔ)是胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，2007年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟(DF)在第二屆“糖尿病前期和代謝綜合癥”國(guó)際會(huì)議

2、上已經(jīng)把糖尿病前期的發(fā)病機(jī)制闡述為胰島素抵抗，可見胰島素抵抗在糖尿病的發(fā)病過程中具有重要的意義。
　　 衰老(年齡增長(zhǎng))和肥胖是增加胰島素抵抗發(fā)生的兩個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。隨著人類壽命的延長(zhǎng)，闡明增齡和肥胖產(chǎn)生胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)理，對(duì)不同年齡人群，特別是老年人的健康及疾病的預(yù)防具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。但到目前為止，胰島素抵抗的分子生物學(xué)機(jī)制還不是十分清楚，而表觀遺傳改變有助于將環(huán)境、年齡與疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)聯(lián)系起來，目前已有證據(jù)顯示表觀遺傳在細(xì)

3、胞和器官的衰老中扮演著重要的角色。在人類隨年齡增長(zhǎng)逐漸衰老的過程中，表觀遺傳標(biāo)記比DNA序列更易受到環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化，它的輕微變化就可能打開或關(guān)閉基因的表達(dá)從而產(chǎn)生一系列的影響，對(duì)胰島素抵抗及糖尿病的發(fā)病可能具有重要的意義。肝臟是胰島素作用的關(guān)鍵器官，肝臟對(duì)胰島素的敏感性降低將導(dǎo)致肝臟的葡萄糖利用降低以及葡萄糖輸出增加，與糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)。研究肝臟在胰島素抵抗以及糖尿病發(fā)病機(jī)理中的作用對(duì)于探討糖尿病的病因以及治療糖尿病具有重

4、要意義。本課題擬從衰老和肥胖兩方面探討肝臟糖代謝相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，為闡述胰島素抵抗和糖尿病的分子生物學(xué)發(fā)生機(jī)制提供依據(jù)。
　　 方法和結(jié)果：
　　 一、不同鼠齡大鼠肝臟糖代謝相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)研究：
　　 1.大鼠的基本指標(biāo)：14周齡(年輕鼠)、40周齡(中年鼠)和80周齡(老年鼠)的Wistar大鼠空腹血糖均正常，但空腹胰島素水平隨鼠齡增高而增高，表明中年及老年鼠處于胰島素抵抗階段。
　　

5、 2.肝臟糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平：肝臟糖代謝基因Glut2，Gck和L-PK基因的表達(dá)水平均隨大鼠的鼠齡增加而降低，肝臟的糖原水平也隨鼠齡的增加而逐漸降低。
　　 3.不同鼠齡大鼠肝臟糖代謝相關(guān)基因的表觀遺傳學(xué)研究：
　　 (1)建立了一種定量DNA甲基化的簡(jiǎn)單可行的方法，即DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后PCR擴(kuò)增并直接測(cè)序，根據(jù)測(cè)序峰值圖中“T”和“G”堿基的峰高計(jì)算CpG位點(diǎn)的甲基化程度。
　　 (2)利用該甲基

6、化定量的方法，檢測(cè)了Glut2、Gck和L-PK基因啟動(dòng)子的DNA甲基化程度，發(fā)現(xiàn)Glut2基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度在不同鼠齡大鼠肝臟中不存在差異，而Gck和L-PK基因啟動(dòng)子的DNA甲基化程度隨大鼠鼠齡增加而逐漸增高，呈現(xiàn)明顯的年齡依賴性特點(diǎn)，提示肝臟Gck和L-PK基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度與其基因的轉(zhuǎn)錄水平可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。
　　 二、肥胖大鼠肝臟糖代謝相關(guān)基因與表觀遺傳學(xué)的研究肥胖是機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗的重要因素之一，我們

7、探討了表觀遺傳學(xué)機(jī)制在肥胖所致的胰島素抵抗中的作用：
　　 1.肥胖大鼠模型的建立：大鼠4周齡開始給予高脂飼料喂養(yǎng)，大鼠體重隨喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而顯著增加，喂養(yǎng)8周(鼠齡為12周)后成功地建立了肥胖合并胰島素抵抗的大鼠模型。
　　 2.肥胖大鼠肝臟糖酵解的兩個(gè)關(guān)鍵基因Gck和L-PK的表達(dá)水平顯著低于正常大鼠；肥胖大鼠的肝糖原顯著低于正常體重大鼠。
　　 3.肥胖大鼠Gck和L-PK基因啟動(dòng)子的甲基化程度顯著高于正常體

8、重大鼠，說明這兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度與基因的轉(zhuǎn)錄水平可能是一種負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示肥胖可能是影響肝臟Gck和L-PK啟動(dòng)子甲基化程度的重要因素之一。
　　 三、游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島素抵抗肝細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)研究通過建立胰島素抵抗肝細(xì)胞模型，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步研究表觀遺傳學(xué)與胰島素抵抗之間的關(guān)系：
　　 1.胰島素抵抗肝細(xì)胞模型的基因表達(dá)變化：濃度為0.1mM的PA誘導(dǎo)大鼠正常肝細(xì)胞株BRL細(xì)胞24h后即成胰島素抵抗細(xì)胞模

9、型(BRL/IR)。該細(xì)胞的Gck基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及酶活均顯著降低，肝糖原含量顯著降低。
　　 2.胰島素抵抗肝細(xì)胞模型的Gck啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度的變化：Gck啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度幾乎在所有的CpG位點(diǎn)中都稍有增加，提示Gck基因表達(dá)與啟動(dòng)子區(qū)的甲基化之間可能存在負(fù)相關(guān)關(guān)系；去甲基化試劑5-Aza-CdR處理過的BRL/IR細(xì)胞Gck基因表達(dá)水平顯著提高。
　　 3.藥物鹽酸小檗堿(BBR)對(duì)BRL/IR細(xì)胞的療效觀察：B

10、BR能夠顯著提高BRL/IR細(xì)胞的葡萄糖消耗量及肝糖原含量；顯著增加Gek基因在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上的表達(dá)量以及Gck的活性；顯著降低BRL/IR細(xì)胞內(nèi)聚集的TG含量。BBR處理過的BRL/IR細(xì)胞Gck啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度稍降低，提示去甲基化機(jī)制可能參與了BBR藥物對(duì)Gck基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控。
　　 4.表達(dá)Gck siRNA和Gck基因的腺病毒制備及對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞作用的初步研究：成功制備了表達(dá)Gck RNA干擾的腺病毒Ad-G

11、ck-siRNA和表達(dá)Gck基因的腺病毒Ad-Gck。實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ad-Gck-siRNA腺病毒能夠顯著降低肝細(xì)胞的Gck基因表達(dá)量，顯著降低肝細(xì)胞的葡萄糖消耗量以及肝糖原含量；Ad-Gck腺病毒能夠在肝細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)Gck基因，顯著提高BRL/IR細(xì)胞的葡萄糖消耗量以及肝糖原含量。通過在肝細(xì)胞中過量表達(dá)或抑制表達(dá)Gck基因，初步證實(shí)了Gck基因在肝細(xì)胞的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)中具有重要的作用，為今后在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行Gck基因的功能研究打下了基礎(chǔ)。<

12、br>　　 結(jié)論：胰島素抵抗是逐步發(fā)展形成的，而衰老和肥胖是產(chǎn)生胰島素抵抗的兩個(gè)重要因素，并與葡萄糖代謝密切相關(guān)。本課題即從表觀遺傳學(xué)的角度分析衰老及肥胖大鼠發(fā)生胰島素抵抗的分子生物學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了肝臟糖代謝關(guān)鍵基因Gck和L-PK在衰老和肥胖兩種胰島素抵抗大鼠肝臟中均存在啟動(dòng)子區(qū)的甲基化程度與基因表達(dá)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，影響了肝臟的胰島素利用及葡萄糖代謝，是參與胰島素抵抗的重要機(jī)制。藥物BBR能夠上調(diào)胰島素抵抗肝細(xì)胞的Gck基因表達(dá)量，同時(shí)