桿狀病毒復(fù)制和基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控研究.pdf

1、在過(guò)去的三十年里,表觀遺傳學(xué)是生命科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn),產(chǎn)生了許多重大的研究成果。但是病毒學(xué)家們似乎對(duì)此無(wú)動(dòng)于衷。直到現(xiàn)在,我們能找到的有關(guān)病毒的表觀遺傳學(xué)調(diào)控的文章都很有限。在這里,比起有潛伏感染期的單純皰疹病毒(HSV)、乙型肝炎病毒(HBV)、Epstein-Barr病毒(EBV)和人類(lèi)乳頭狀瘤病毒(HPV),裂解性復(fù)制病毒復(fù)制周期中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控更少被關(guān)注。本文重點(diǎn)研究了桿狀病毒苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographac

2、alifornicamulticapsidnucleopolyhedrosis,AcMNPV)在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行裂解性復(fù)制時(shí)的一些表觀遺傳學(xué)現(xiàn)象,包括病毒小染色體結(jié)構(gòu)、組蛋白乙?；揎椇虳NA甲基化修飾在桿狀病毒的復(fù)制和基因表達(dá)中的作用。
　　首先,我們證明了病毒小染色體結(jié)構(gòu)和組蛋白乙?；揎椩诓《净蜣D(zhuǎn)錄中的作用。我們證實(shí)插入在病毒polyhedrin位點(diǎn)下游的雞β-珠蛋白5'-HS4絕緣子(HS4)能顯著提高polyhedrin

3、啟動(dòng)子控制的報(bào)告基因的表達(dá)水平。當(dāng)使用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(egfp)作為報(bào)告基因時(shí),在感染后72h和96h,帶HS4的重組病毒(AcEGFP-HS4)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞比不帶HS4的對(duì)照病毒(AcEGFP)感染的細(xì)胞熒光分別高3倍和2.1倍。AeEGFP-HS4感染的細(xì)胞的egfp的mRNA水平也較AcEGFP感染的細(xì)胞高。在以螢火蟲(chóng)熒光素酶(fireflyluciferase)或分泌型堿性磷酸酶(SEAP)為報(bào)告基因時(shí),也觀察到類(lèi)似的表達(dá)

4、水平的提高。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明,polyhedrin位點(diǎn)插入的HS4沒(méi)有顯著影響到病毒復(fù)制,而HS4的作用具有方向性且對(duì)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑敏感。從DNaseI敏感實(shí)驗(yàn)看出,HS4的存在顯著提高了附近DNA對(duì)核酸酶的敏感性,但對(duì)距離較遠(yuǎn)的DNA沒(méi)有作用。這些結(jié)果表明HS4可能通過(guò)改變?cè)诓《拘纬傻男∪旧w上鄰近染色體結(jié)構(gòu)來(lái)影響病毒基因表達(dá)。這一研究結(jié)果為提高桿狀病毒.昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目標(biāo)蛋白的效率提供了新的途徑,也明確提示在桿狀

5、病毒裂解性復(fù)制過(guò)程中,病毒小染色體的結(jié)構(gòu)及組蛋白的乙?；揎棇?duì)病毒基因的表達(dá)起著重要的作用。
　　為了揭示其它表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制在桿狀病毒復(fù)制過(guò)程中的作用,我們進(jìn)一步研究了病毒復(fù)制過(guò)程中的DNA甲基化問(wèn)題。我們首次證實(shí)病毒極早期基因ie0的轉(zhuǎn)錄受DNA甲基化調(diào)控。IE0是病毒的一個(gè)重要調(diào)控因子,在感染早期表達(dá)水平相對(duì)較高,而在感染晚期轉(zhuǎn)錄下調(diào)。這種表達(dá)水平的變化對(duì)病毒復(fù)制具有重要意義。我們發(fā)現(xiàn):在感染后Oh(0hp.i.)ie0啟

6、動(dòng)子甲基化程度較高,8hp.i.時(shí)甲基化程度明顯降低,但從18hp.i.起,這一區(qū)域甲基化程度又明顯提高。體外DNA甲基化修飾實(shí)驗(yàn)表明DNA甲基化可以抑制ie0表達(dá)。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DNMTi)DAC(50nM)的存在有助于維持ie0啟動(dòng)子低甲基化,并顯著增加ie0的表達(dá)。這些研究結(jié)果證實(shí)啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化是ie0在感染晚期轉(zhuǎn)錄下調(diào)的原因,表明DNA甲基化在裂解性復(fù)制病毒基因表達(dá)的調(diào)控中也有重要作用。
　　為了全局性

7、的了解DNA甲基化調(diào)控在病毒復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄中的作用,我們還研究了DAC對(duì)病毒復(fù)制和基因轉(zhuǎn)錄的影響。用50nMDAC處理,可使AcMNPV感染Sf9細(xì)胞時(shí)病毒效價(jià)下降到對(duì)照的1/30,并顯著地延遲病毒DNA復(fù)制。DAC處理對(duì)病毒極早期基因的表達(dá)在感染后不同階段有不同的影響。在2hp.i.,DAC可以提高病毒極早期基因ie1和ie2的表達(dá),而在感染晚期,DAC抑制把ie1和ie2的轉(zhuǎn)錄。但是在整個(gè)復(fù)制周期中,DAC都提高ie0的轉(zhuǎn)錄。DAC

8、對(duì)病毒滯早期基因轉(zhuǎn)錄的影響不均一,但抑制晚期基因的轉(zhuǎn)錄。DAC對(duì)病毒極晚期啟動(dòng)子的活性的抑制作用尤為明顯。對(duì)于DAC抑制極晚期啟動(dòng)子的機(jī)制我們進(jìn)行了進(jìn)一步的研究,發(fā)現(xiàn)用質(zhì)粒額外表達(dá)IE1可以緩解DAC的對(duì)極晚期啟動(dòng)子的抑制作用。這些數(shù)據(jù),結(jié)合前面的結(jié)果和對(duì)IE0,IE1功能已有的認(rèn)識(shí),提示在感染的后期,DAC是通過(guò)抑制ie1的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)避免ie0轉(zhuǎn)錄的降低,改變了IE0,IE1兩個(gè)蛋白的相對(duì)比例,從而抑制了極晚期啟動(dòng)子的激活。這一研究結(jié)

9、果表明DNA甲基化對(duì)病毒復(fù)制的調(diào)控作用可能主要是通過(guò)影響關(guān)鍵調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　除了感染昆蟲(chóng)細(xì)胞以外,桿狀病毒還能高效地侵入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞。它作為一種新型哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)導(dǎo)載體正在受到越來(lái)越多的重視。但目標(biāo)基因的表達(dá)沉默限制了桿狀病毒這方面的應(yīng)用。盡管人們?cè)缫寻l(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶抑制劑可以提高桿狀病毒介導(dǎo)的基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá),但另一類(lèi)引起表觀遺傳學(xué)修飾變化的藥物,DNMTi卻被報(bào)道沒(méi)有這種效果。在本論文中,我們首次

10、發(fā)現(xiàn)在病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞前使用DNMTiAZA或DAC處理細(xì)胞,在多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中桿狀病毒介導(dǎo)的基因的表達(dá)水平均有四倍的提高;但如果添加藥物的時(shí)間推遲,則其提高表達(dá)水平的作用會(huì)減弱乃至消失。同時(shí)在病毒接種期間有DNMTi的存在對(duì)其發(fā)揮作用至關(guān)重要。進(jìn)一步的結(jié)果表明DNMlTi可能是通過(guò)抑制細(xì)胞對(duì)病毒DNA降解起作用。這項(xiàng)研究為提高桿狀病毒載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中應(yīng)用的效果提供了新途徑,也為揭示桿狀病毒與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的作用關(guān)系,認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)