沉默SEPT9基因對人肝癌MHCC97-H細胞生物學特性的影響.pdf

1、目的:根據(jù)SEPT9基因序列設計并合成相應SEPT9-siRNA,探討SEPT9-siRNA對人肝癌細胞系MHCC97-H細胞生長特異性抑制作用及其凋亡的影響,進一步揭示SEPT9基因在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。
　　方法:根據(jù)SEPT9基因核苷酸序列設計4對針對SEPT9基因的靶序列,由生物公司構建4個針對SEPT9基因的siRNA,同時構建不針對任何基因的帶有綠色熒光蛋白基因的siRNA,預實驗篩選出一個有效siRNA,其靶序

2、列為GGCAGCCCATCATGAAGTTCA。培養(yǎng)MHCC97-H細胞,待細胞生長狀態(tài)良好并達到指數(shù)生長期時,于轉染前一日接種于6孔板(CCK-8法檢測MHCC97-H細胞生長抑制情況用96孔板接種),設實驗組、陰性對照組和空白組。以每孔脂質體LipofectamineTM20007.5ug,重組siRNA3ug配成轉染復合物,加入各孔MHCC97-H細胞中進行轉染(空白組不加任何試劑)。轉染后48h熒光顯微鏡下觀察綠色熒光細胞所占比

3、例,判斷轉染效率。①RT-PCR法檢測SEPT9mRNA的表達抑制情況:轉染后48h,提取各組細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA,并經(jīng)PCR反應擴增,瓊脂糖凝膠電泳,最后凝膠成像分析系統(tǒng)吸光度掃描觀察結果。②用westernblot法檢測SEPT9蛋白質的表達抑制情況:轉染后48h,提取各組細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,以GAPDH蛋白為內(nèi)對照進行SDS-PAGE電泳,半干法轉膜,一抗、二抗雜交孵育,化學發(fā)光液顯影并用紫外凝膠成像分析

4、系統(tǒng)自動曝光,結果用凝膠成像儀掃描QuantityOne4.4.0軟件分析,檢測各組SEPT9蛋白的相對表達量。③以0h、24h、48h、72h為時間點,用CCK-8法檢測SEPT9-siRNA對細胞生長抑制的影響。④轉染后48h用流式細胞技術AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測各組MHCC97-H細胞凋亡率。⑤細胞劃痕實驗檢測各組MHCC97-H細胞0h、24h、48h、72h的遷移率。
　　結果:①轉染后48h熒光顯微鏡

5、下觀察,根據(jù)發(fā)綠色熒光的MHCC97-H細胞所占比率判斷LipofectamineTM2000轉染MHCC97-H細胞的轉染效率達75％以上。②RT-PCR法檢測結果顯示:實驗組SEPT9條帶亮度明顯弱于兩對照組,灰度掃描半定量結果顯示實驗組MHCC97-H細胞中SEPT9mRNA表達水平顯著底于兩對照組。③免疫印跡分析顯示:各組內(nèi)對照GAPDH蛋白條帶的亮度相似,而septin-9蛋白條帶亮度實驗組明顯弱于其它兩組。QuantityO

6、ne4.4.0軟件分析結果顯示,實驗組、陰性對照組、空白組septin-9蛋白的相對表達量分別為0.448±0.044、1.844±0.047、1.876±0.036。經(jīng)SNK-q檢驗方差分析,實驗組septin-9蛋白相對表達量分別與空白組及陰性對照組相比,均下降76%左右,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),而其它兩組之間相比,無顯著性差異(P>0.05)。④CCK-8法檢測結果顯示;在0h~72h范圍內(nèi),實驗組與空白組、陰性對照組的

7、OD值相比較,差異具有顯著性(P<0.01),其它兩組之間相比,無顯著性差異(P>0.05);表明SEPT9-siRNA對MHCC97-H細胞生長有明顯抑制作用。⑤流式細胞儀檢測顯示:空白對照組、陰性對照組、實驗組轉染72h細胞凋亡率分別為(28.28±3.45)%、(5.65±1.56)%、(5.33±1.81)%,經(jīng)q檢驗方差分析,實驗組轉染后12h細胞凋亡率即開始升高(P﹤0.01),隨后逐漸升高,72h凋亡率達到最高,而陰性對照

8、組較空白對照組無顯著差異(P﹥0.05)。⑥細胞劃痕實驗結果分析,與空白對照組和陰性對照組相比,實驗組劃痕寬度明顯縮小,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),空白對照組和陰性對照組兩者間劃痕寬度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論:1.針對SEPT9基因的RNAi靶序列設計有效;合成的siRNA通過脂質體介導的方法能高效轉染MHCC97-H細胞,并有效抑制MHCC97-H細胞中相應基因的表達。2.靶向SEPT9的siRNA能顯