鞘氨醇激酶1對肝癌耐藥細胞生物學特性的影響.pdf

1、目的：近年來研究表明鞘脂代謝產(chǎn)物是重要的細胞信號轉(zhuǎn)導分子，它們參與腫瘤浸潤、增殖及血管生成的調(diào)節(jié)，其中神經(jīng)酰胺（Ceramide Cer）及鞘氨醇(Sphingosine SP)和1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phospate S1P)的動態(tài)平衡決定腫瘤細胞的凋亡和存活，三者之間的平衡受多種酶的嚴格調(diào)控，鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinasel，SPK1)的作用最為關鍵，其催化SP形成S1P,不僅增加促進生長、抑

2、制凋亡的信使S1P，還能減少有促進凋亡作用的Cer、SP。本課題研究利用攜帶目的基因的重組腺病毒感染肝癌耐藥細胞株BEL-FU后對肝癌細胞凋亡、侵襲能力、耐藥特性的影響。
　　 方法：病毒包裝細胞AD293細胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100u/L青霉素、100μ/L鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，用0.25％胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，擴增并純化攜帶野生型SPK1基因(Ad-SPK

3、1WT)和干涉型SPK1基因(Ad-H1-SPK1)的重組腺病毒，以TCID50方法（IU/ml）和快速CPE法(IU/ml)測定腺病毒感染滴度。人肝癌耐藥細胞株BEL-FU培養(yǎng)于含10％胎牛血清、100u/L青霉素、100μ/L鏈霉素、20000ng/L5-FU的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)，以0.25％胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，采用對數(shù)生長期的細胞進行實驗。將干涉型SPK1基因(Ad-H1-S

4、PK1)及野生型SPK1基因(Ad-SPK1WT)導入人肝癌耐藥細胞株BEL-FU中；用酶活性檢測試劑盒測定SPK酶活性，MTT法檢測其對肝癌耐藥細胞凋亡特性的影響，Transwell法測定其對肝癌細胞侵襲力的影響，western-blot方法檢測多藥耐藥相關蛋白1(MRP1)表達水平的變化。
　　 結果：⑴重組腺病毒擴增并純化氯化銫密度梯度離心后可獲得高度濃縮的腺病毒。⑵重組腺病毒對BEL-FU感染效率的測定及SPK1基因轉(zhuǎn)移

5、以Ad-EGFP評價腺病毒對BEL-FU細胞的感染效率。當MOI=150時可見到幾乎滿視野的熒光，且對BEL-FU無明顯毒作用。⑶SPK酶活性測定利用多功能酶標儀檢測標準孔及實驗孔，根據(jù)數(shù)值做標準曲線R2=1，感染攜帶Ad-SPK1WT基因腺病毒的BEL-FU細胞SPK活性明顯強于感染攜帶Ad-H1-SPK1基因的BEL-FU細胞，三者之間經(jīng)單因素方差分析P＜0.05，有統(tǒng)計學意義。⑷鞘氨醇激酶對肝癌耐藥細胞凋亡特性的影響5-25μmo

6、l/1濃度范圍的DMS(N，N，-二甲基鞘氨醇)對細胞增殖均有抑制作用，細胞存活率隨藥物濃度升高而降低。⑸鞘氨醇激酶對肝癌耐藥細胞侵襲力的影響攜帶Ad-SPK1WT基因的BEL-FU細胞的平均侵襲細胞數(shù)明顯多于攜帶Ad-GFP的對照組，而攜帶Ad-H1-SPK1基因的BEL-FU細胞的平均侵襲細胞數(shù)明顯少于對照組，說明過表達SPK的肝癌細胞侵襲力增強，而干涉SPK則降低肝癌細胞的侵襲力。⑹鞘氨醇激酶對MRP1表達的影響Western b

7、lot結果顯示：Ad-SPK1WT、對照組及Ad-H1-SPK1均有MRP1的表達，且攜帶Ad-SPK1WT多于對照組，而攜帶Ad-H1-SPK1則少于對照組。Ad-SPK1WT、對照組及Ad-H1-SPK1與β-actin的積分密度比值分別為0.94±0.05，0.77±0.07，0.58±0.05，具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 結論：①能獲得高感染滴度的Ad-SPK1WT腺病毒和Ad-H1-SPK1腺病毒。②攜帶A

8、d-SPK1WT及Ad-H1-SPK1的重組腺病毒能高效感染BEI-FU細胞株。③攜帶Ad-SPK1WT的重組腺病毒感染BEL-FU細胞后增強細胞中SPK活性；攜帶Ad-H1-SPK1的重組腺病毒感染BEL-FU細胞后降低細胞中SPK活性。④攜帶Ad-SPK1WT的重組腺病毒感染BEL-FU細胞后降低DMS(N，N，-二甲基鞘氨醇)對肝癌細胞的促凋亡作用；而攜帶Ad-H1-SPK1的重組腺病毒感染BEL-FU細胞后增強DMS對肝癌細胞的