泛素連接酶(E3)gp78的RNA干擾對MHCC97-H細(xì)胞生物學(xué)行為及KAI1表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景及目的
　　 肝癌是導(dǎo)致人類死亡率第二高的惡性腫瘤,尤其是其肝外轉(zhuǎn)移,更是臨床肝癌治療的難點(diǎn)。肝癌細(xì)胞通常早期經(jīng)過血道轉(zhuǎn)移至鄰近或遠(yuǎn)處的組織器官,因此肝癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移侵襲能力,而這種轉(zhuǎn)移侵襲行為的發(fā)生機(jī)制則十分復(fù)雜。越來越多的研究認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng),是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一。先前在動(dòng)物細(xì)胞株進(jìn)行的研究已經(jīng)表明,gp78,作為一種與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性蛋白降解途徑(ERAD)相關(guān)的泛素連接酶(E3),其過

2、表達(dá)誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞表型的變化,而這種變化卻增強(qiáng)了細(xì)胞的存活能力和增殖能力,細(xì)胞的侵襲潛力和活動(dòng)能力也有所增強(qiáng)。最近有研究報(bào)道,腫瘤組織中g(shù)p78 mRNA水平表達(dá)較鄰近正常組織有顯著增高,并且有研究表明,腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子KAI1是gp78的特異性作用底物,gp78的E3酶活性可以通過對骨肉瘤細(xì)胞中腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子KAI1的降解來促進(jìn)骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。但是在肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移侵襲過程當(dāng)中,gp78所發(fā)揮的作用現(xiàn)在還不太明了,尤其是在體外gp78對

3、肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響仍不清楚。
　　 在本研究中,我們假設(shè)肝癌細(xì)胞中g(shù)p78表達(dá)減少可能導(dǎo)致KAI1表達(dá)水平的增高,從而使腫瘤細(xì)胞增殖、形成克隆以及遷移和侵襲能力的下降,進(jìn)而推斷可能減弱肝癌的轉(zhuǎn)移能力。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè),我們運(yùn)用RNAi技術(shù)沉默肝癌細(xì)胞MHCC97-H中g(shù)p78的表達(dá),檢測gp78沉默前后肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)活性的變化,同時(shí)也檢測了gp78沉默前后肝癌細(xì)胞中KAI1的表達(dá)。
　　 研究方

4、法
　　 1、根據(jù)gp78基因序列(GeneBank NM_001144,通過www.genscript.com網(wǎng)站在線siRNA設(shè)計(jì)工具,設(shè)計(jì)三對siRNA,定向插入到質(zhì)粒pRNA-U6-1/Neo,抽提質(zhì)粒并測序鑒定。構(gòu)建好的三種gp78干擾載體分別命名為pRNAi-1,pRNAi-2與pRNAi-3。將細(xì)胞接種于6孔板,待細(xì)胞融合率達(dá)80％～90％時(shí),用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染方法將構(gòu)建好的gp78干擾載體與空載體轉(zhuǎn)入MHCC

5、97-H細(xì)胞,經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。
　　 2、采用不同的實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測gp78 RNAi前后MHCC97-H細(xì)胞增殖能力、克隆形成能力、遷移能力和侵襲能力的變化。
　　 3、運(yùn)用RT-PCR與Western Blot法檢測gp78 RNAi前后MHCC97-H細(xì)胞中g(shù)p78與KAI1的表達(dá)。
　　 結(jié)果
　　 1、構(gòu)建的干擾重組載體經(jīng)測序比對,插入的寡核苷酸序列與設(shè)計(jì)的靶點(diǎn)序列完全吻合,說明干

6、擾重組載體構(gòu)建成功,經(jīng)過G418篩選和克隆挑選,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,轉(zhuǎn)染細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下可發(fā)出綠色熒光。
　　 2、3種siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒有兩種可以有效抑制gp78的表達(dá),其中以pRNAi-2作用效果最為明顯。
　　 3、MTT實(shí)驗(yàn)表明干擾組細(xì)胞增殖能力明顯低于MHCC97-H組和空載體組細(xì)胞；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明干擾組單個(gè)細(xì)胞形成克隆的能力與MHCC97-H組和空載體組細(xì)胞相比顯著降低；細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)表

7、明干擾組細(xì)胞遷移能力明顯低于MHCC97-H組和空載體組細(xì)胞；Transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)表明干擾組細(xì)胞侵襲能力與MHCC97-H組和空載體組細(xì)胞相比顯著降低；
　　 4、運(yùn)用RT-PCR與Western Blot檢測,干擾組細(xì)胞的。KAI1表達(dá)高于MHCC97-H和空載體組細(xì)胞。
　　 結(jié)論
　　 gp78特異性RNA干擾能有效抑制MHCC97-H細(xì)胞中g(shù)p78的表達(dá),并上調(diào)了KAI1基因的表達(dá),從而間接降低