聯(lián)合基因治療骨關(guān)節(jié)炎-IL-1Ra聯(lián)合自殺基因HSV-TK體內(nèi)轉(zhuǎn)染治療兔膝骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　 骨性關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是老年人群發(fā)病率較高的疾病之一，是在全身因素和局部因素的綜合作用下，關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生生化、結(jié)構(gòu)和代謝改變，最終出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨軟化、破潰和局部剝脫以及關(guān)節(jié)邊緣骨與軟骨贅生物形成等病理改變，臨床上可產(chǎn)生關(guān)節(jié)疼痛、活動(dòng)受限和關(guān)節(jié)畸形等癥狀，嚴(yán)重影響老年人的身體健康，是致殘的重要原因。在骨關(guān)節(jié)炎的病理改變中，大量炎性介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放是造成局部關(guān)節(jié)改變的重要因素。其中IL-1和T

2、NF-a是OA病理過(guò)程中促進(jìn)軟骨基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞的兩種最重要的細(xì)胞因子，其他細(xì)胞因子對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的破壞往往是間接通過(guò)IL-1和TNF-a發(fā)揮作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)OA的發(fā)病機(jī)制和治療研究很多，但療效不盡如人意，近些年來(lái)自殺基因治療為骨關(guān)節(jié)炎的治療提供了一種新的方法。本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用基因治療的方法，利用重組重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)，將外源性抑炎性因子基因聯(lián)合自殺基因直接體內(nèi)轉(zhuǎn)染兔膝關(guān)節(jié)后，觀察對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療效果。有可能在骨關(guān)節(jié)炎

3、的治療上去的新的進(jìn)展。
　　 方法：
　　 采用切斷并切除前交叉韌帶及內(nèi)側(cè)半月板的方法將32只新西蘭白兔的右后膝關(guān)節(jié)制成OA的動(dòng)物模型，將兔子平均分成四組，將有rAAV包裝的目的基因通過(guò)髕韌帶注射入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，A組rAAV2/1-IL-1Ra1ml，B組rAAV2/1-HSV-tk1ml，C組rAAV2/1-TK--IL-1Ra1ml，D組為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染含空質(zhì)粒的rAAV2/11ml。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射24小時(shí)后，每只動(dòng)物給予靜

4、脈內(nèi)注射更昔洛韋(GCV)5mg/天，一天兩次，持續(xù)三天。注射后第7天，用1ml生理鹽水灌洗關(guān)節(jié)腔，抽取關(guān)節(jié)腔灌洗液用ELISA分析外源基因的表達(dá)情況，注射后第14天，處死動(dòng)物，用無(wú)菌生理鹽水1ml灌洗關(guān)節(jié)腔，抽取關(guān)節(jié)罐洗液進(jìn)行IL-1Ra、IL-1β、TNF--a及TGF-β1的ELISA分析，取滑膜組織通過(guò)rea1-timePCR方法檢測(cè)目的基因的表達(dá)，并用相對(duì)定量的方法—2-△△CT進(jìn)行目的基因表達(dá)的分析，目的基因包括:IL-1β

5、、TNF-α、及TGF-β1。取關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行固定，包埋，切片和HE染色及番紅O染色，鏡下觀察軟骨細(xì)胞排列情況，并進(jìn)行軟骨組織學(xué)評(píng)分。
　　 結(jié)果：
　　 通過(guò)ELISA檢測(cè)分析接受IL-1Ra基因治療的A組及IL-1Ra聯(lián)合HSV-tk基因治療的C組在外源基因注射后第7天和第14天，關(guān)節(jié)液內(nèi)有穩(wěn)定的外源基因IL-1Ra的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染HSV-tk基因的B組及未有基因轉(zhuǎn)染的對(duì)照組D組未檢測(cè)到人IL-1Ra的表達(dá)。說(shuō)明外源基因

6、能在關(guān)節(jié)腔內(nèi)表達(dá)。
　　 通過(guò)real-timePCR檢測(cè)目的基因的表達(dá)量，IL-1β的表達(dá)量三個(gè)實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組，此外C組即IL-1Ra聯(lián)合HSV-tk基因治療組明顯低于A組IL-1Ra基因治療組和B組HSV-tk基因治療組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;TNF-α的表達(dá)量對(duì)照組高于三個(gè)實(shí)驗(yàn)組，聯(lián)合基因治療組低于單基因治療組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;TGF-β1的表達(dá)量對(duì)照組明顯高于三個(gè)實(shí)驗(yàn)組。
　　 通過(guò)ELISA檢測(cè)，IL-1β

7、在A組、B組、C組的水平明顯低于對(duì)照組D組，TNF-α的表達(dá)水平在對(duì)照組明顯高于三個(gè)治療組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;TGF-β1水平對(duì)照組明顯高于導(dǎo)入外源性基因的A、B、C三組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以平均值±SEM表示，n=3，P＜0.05。
　　 HE染色及番紅O示染色未轉(zhuǎn)染基因的對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙并有軟骨剝脫，外源性基因?qū)牒螅浌菗p害及軟骨基質(zhì)降解明顯減輕。關(guān)節(jié)軟骨的Mankin's評(píng)分顯示對(duì)照組的評(píng)分8.264±-0.044明顯高于三

8、個(gè)基因治療組，而聯(lián)合基因治療組的評(píng)分明顯低于兩組單一基因治療組。
　　 結(jié)論：
　　 我們將攜帶目的基因的重組腺相關(guān)病毒載體注射入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，使其在體內(nèi)表達(dá)相應(yīng)的目的基因。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)，IL-1Ra因聯(lián)合自殺基因HSV-tk對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的基因治療優(yōu)于單純的使用IL-1Ra基因或HSV-tk基因治療，不僅可以有效地減少豐要促炎性因子——IL-1β的含量，減輕滑膜炎癥，同時(shí)還可以減輕軟骨損害和軟骨基質(zhì)