關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的重組人IL-1Ra和TGF-β1基因治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病，多發(fā)于老年人群，以女性多見(jiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，消耗大量的個(gè)人及社會(huì)財(cái)力。目前，OA的治療包括傳統(tǒng)的藥物治療和外科手段，療效有限，無(wú)法阻止OA的進(jìn)一步發(fā)展。近年來(lái)，應(yīng)用組織工程技術(shù)，通過(guò)組織和/或細(xì)胞移植來(lái)獲得更多的接近于正常的透明軟骨，從而達(dá)到軟骨修復(fù)的目的。但是，由于組織和種子細(xì)胞的來(lái)源有限，限制了該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，尤其對(duì)缺損較為嚴(yán)重軟骨組織。基因轉(zhuǎn)染為組

2、織工程的發(fā)展開(kāi)辟了新的途徑，將功能基因片段整合到基因載體內(nèi)，再將基因載體轉(zhuǎn)染入靶細(xì)胞中或轉(zhuǎn)染入關(guān)節(jié)腔內(nèi)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因的靶細(xì)胞持續(xù)大量分泌功能基因產(chǎn)物，在一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)期保持局部較高的治療濃度，從而達(dá)到治療目的。目前已有許多研究表明基因治療對(duì)OA的有效性，并且多基因聯(lián)合治療OA效果好于單基因。關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)和功能依賴于其合成代謝與分解代謝的相互作用和平衡，一方面，合成代謝中的生長(zhǎng)因子以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)家族為主，另一方面，分解代謝

3、中的炎性因子以白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為主。在臨床應(yīng)用之前，我們有必要在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中確證哪些功能基因或基因的組合會(huì)對(duì)OA產(chǎn)生更好的治療效果。本實(shí)驗(yàn)，以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體將重組人IL-1Ra(分解代謝因子IL-1受體拮抗蛋白)和TGF-β1(合成代謝重要因子)基因轉(zhuǎn)染至正常的軟骨細(xì)胞及OA的軟骨細(xì)胞，觀察其對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響；另外我們將基因直接注射到兔膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的關(guān)節(jié)內(nèi)，從促進(jìn)軟骨細(xì)胞及基

4、質(zhì)合成和抑制軟骨細(xì)胞及基質(zhì)分解兩個(gè)層面來(lái)研究治療OA的療效。
　　 第一部分聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染兔膝正常軟骨細(xì)胞及OA軟骨細(xì)胞
　　 對(duì)其增殖代謝的影響
　　 目的：觀察以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，介導(dǎo)白細(xì)胞介素-1受體拮抗蛋白(IL-1Ra)基因與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)基因共轉(zhuǎn)染兔膝關(guān)節(jié)正常及OA軟骨細(xì)胞后，觀察IL-1Ra及TGF-β1基因含量的表達(dá)，及對(duì)正常及OA軟骨細(xì)胞增殖代謝的影響。
　　 方法：將

5、體外培養(yǎng)的正常及OA軟骨細(xì)胞分別分為空白轉(zhuǎn)染組、空載體轉(zhuǎn)染組、IL-1Ra單基因轉(zhuǎn)染組、TGF-β1單基因轉(zhuǎn)染組及IL-1Ra和TGF-β1雙基因轉(zhuǎn)染組。用酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)對(duì)其分別進(jìn)行瞬時(shí)基因表達(dá)(基因轉(zhuǎn)染后48h)。
　　 結(jié)果：基因轉(zhuǎn)染48h后，正常軟骨細(xì)胞及OA軟骨細(xì)胞空白組與PLNCX2空載體轉(zhuǎn)染組的上述指標(biāo)差異無(wú)顯著性(P＞0.05)；基因轉(zhuǎn)染組有明顯基因表達(dá)，與空白組及PLNCX2空載體轉(zhuǎn)染組相比(P

6、＜0.05)，雙基因轉(zhuǎn)染組較單基因轉(zhuǎn)染組IL-1Ra、TGF-β1含量均明顯提高(P＜0.01)。IL-1Ra單基因轉(zhuǎn)染時(shí)在正常軟骨細(xì)胞與OA軟骨細(xì)胞比較IL-1Ra含量差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，與TGF-β1雙基因轉(zhuǎn)染時(shí)在正常軟骨細(xì)胞與OA軟骨細(xì)胞IL-1Ra含量比較差異有顯著性(P＜0.05)；TGF-β1單基因轉(zhuǎn)染和雙基因轉(zhuǎn)染時(shí)在正常軟骨細(xì)胞與OA軟骨細(xì)胞中TGF-β1含量比較差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論

7、：基因轉(zhuǎn)染正常軟骨細(xì)胞及OA軟骨細(xì)胞后可獲得穩(wěn)定表達(dá)，IL-1Ra+TGF-β1雙基因轉(zhuǎn)染的軟骨細(xì)胞生物學(xué)活性優(yōu)于兩者中的任一單基因轉(zhuǎn)染，為基因治療骨關(guān)節(jié)炎的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。OA軟骨細(xì)胞較正常軟骨細(xì)胞生物學(xué)活性較弱，對(duì)IL-1Ra、TGF-β1單基因和雙基因轉(zhuǎn)染反應(yīng)性能不如正常軟骨細(xì)胞強(qiáng)。
　　 第二部分關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的重組人IL-1Ra和TGF-β1基因治療兔膝骨關(guān)節(jié)炎的研究
　　 目的：觀察膝關(guān)節(jié)內(nèi)

8、注射逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的白細(xì)胞介素-1受體拮抗蛋白(IL-1Ra)與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)基因在關(guān)節(jié)中的表達(dá)及對(duì)OA的治療效果。
　　 方法：用前交叉韌帶切斷法(ACLT)制造新西蘭白兔膝OA模型，共30只，隨機(jī)分為5組，Ⅰ組為空白對(duì)照組(未行ACLT處理)，Ⅱ組為手術(shù)對(duì)照組，Ⅲ組為IL-1Ra轉(zhuǎn)染組，Ⅳ組為TGF-β1轉(zhuǎn)染組，Ⅴ組為IL-1Ra和TGF-β1雙基因轉(zhuǎn)染組。外源基因注射后4周和8周，用PBS灌洗兔膝關(guān)節(jié)，

9、獲取關(guān)節(jié)液ELISA分析轉(zhuǎn)基因表達(dá)，取關(guān)節(jié)標(biāo)本進(jìn)行Mankin's評(píng)分，阿爾辛藍(lán)-過(guò)碘酸雪夫試劑(AB-PAS)染色，TGF-β1、IL-1Ra及Ⅱ型膠原原位雜交和免疫組化檢測(cè)。
　　 結(jié)果：在基因注射后4周和8周，空白對(duì)照組的大體評(píng)分和Mankin's評(píng)分明顯低于手術(shù)對(duì)照組差異有顯著性(P＜0.01)，手術(shù)對(duì)照組的大體評(píng)分和Mankin's評(píng)分高于單基因轉(zhuǎn)染組和雙基因轉(zhuǎn)染組差異有顯著性(P＜0.05)，基因治療8周與4周比較，

10、各對(duì)應(yīng)組評(píng)分普遍提高，但差異無(wú)顯著性意義(P＞0.05)。關(guān)節(jié)液ELISA分析顯示空白對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組比較各因子含量無(wú)明顯差別差異無(wú)顯著性(P＞0.05)，與單基因轉(zhuǎn)染組和雙基因轉(zhuǎn)染組比較TGF-β1、IL-1Ra含量明顯增高差異有顯著性(P＜0.05)；單基因轉(zhuǎn)染組與雙基因轉(zhuǎn)染組比較，4周時(shí)雙基因轉(zhuǎn)染組各因子含量明顯高于單基因轉(zhuǎn)染組差異有顯著性(P＜0.05)，而8周時(shí)雙基因轉(zhuǎn)染組各因子含量略高于單基因轉(zhuǎn)染組差異無(wú)顯著性(P＞0.0

11、5)，8周與4周比較各基因含量有所減少，差異有顯著性(P＜0.05)。各基因轉(zhuǎn)染組原位雜交和免疫組織化學(xué)染色較空白對(duì)照組和手術(shù)對(duì)照組深，灰度值比較差異有明顯差異(P＜0.01)，單基因轉(zhuǎn)染組與雙基因轉(zhuǎn)染組灰度值比較差異有明顯差異(P＜0.01)，基因治療8周后，各對(duì)應(yīng)組染色陽(yáng)性細(xì)胞較4周時(shí)減少，除空白對(duì)照組與手術(shù)對(duì)照組外，各組灰度值與4周時(shí)比較均有差異有顯著性差異(P＜0.05)，8周時(shí)基因表達(dá)有所減弱。
　　 結(jié)論：以逆轉(zhuǎn)錄病