IL-1Ra和IL-10聯(lián)合基因治療在骨關節(jié)炎中的作用及分子機制.pdf

1、目的：前期動物實驗已初步證實：IL-1Ra和IL-10聯(lián)合基因轉染的同種異體滑膜細胞行關節(jié)腔注射后，可定位于滑膜襯里，并有穩(wěn)定的外源基因表達，且治療效果明顯優(yōu)于單獨導入其中任何一種基因。但并不知道，聯(lián)合基因轉染對于更具有臨床意義的人膝關節(jié)滑膜細胞和軟骨細胞，是否也獲得良好的生物學作用，能否有效轉染并穩(wěn)定表達，對于細胞增殖有何影響，同時不同基因轉染的軟骨細胞中是否存在差異表達的基因？在前期研究的基礎上，本研究中我們通過構建逆轉錄病毒載體P

2、LXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10，體外IL-1Ra和IL-10聯(lián)合基因轉染OA患者滑膜細胞和軟骨細胞，多個水平檢測目的基因表達及觀察基因轉染對細胞生物學的作用，探討IL-1Ra和IL-10基因在人OA治療中的可行性和作用。同時以反義DNA（cDNA）陣列技術對OA軟骨細胞的基因表達譜特征進行研究，比較不同目的基因轉染后OA軟骨細胞的基因表達譜，尋找基因治療前后軟骨細胞中差異表達的基因，進一步探討聯(lián)合基因治療OA的分子機制，

3、從而為OA發(fā)病機制的進一步闡明提供依據(jù)。 方法： 1. 逆轉錄病毒載體PLXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10的構建和鑒定，病毒包裝和滴度的測定：構建真核表達質粒PcDNA3.1-IL-1Ra和PcDNA3.1-IL-10；真核表達質粒轉化、篩選、擴增后進行基因測序并與Genbank中的相應序列比對；構建逆轉錄病毒載體PLXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10；限制性內切酶酶切鑒定；細胞株PT67和 NIH

4、/3T3的體外培養(yǎng)及G418最佳的篩選濃度的確定；PT67細胞包裝逆轉錄病毒載體PLXRN、PLXRN-IL-1Ra和PLXRN-IL-10；G418篩選產病毒細胞株獲得陽性克隆,擴增后收集病毒原液；使用NIH/3T3測定PLXRN、PLXRN-IL-1Ra和PLXRN-IL-10病毒滴度。 2.IL-1Ra和IL-10聯(lián)合基因轉染在OA患者滑膜細胞、軟骨細胞中的表達及生物學作用：原代滑膜細胞、軟骨細胞體外培養(yǎng)；實驗共分5組，分

5、別為未轉染組（A組）、PLXRN空質粒轉染組（B組）、PLXRN-IL-1Ra轉染組（C組）、PLXRN-IL-10轉染組（D組）和PLXRN-IL-1Ra+PLXRN-IL-10聯(lián)合基因轉染組（E組）。PLXRN、PLXRN-IL-1Ra和PLXRN-IL-10病毒單獨或聯(lián)合基因轉染OA患者第3代滑膜細胞和原代軟骨細胞；滑膜細胞和軟骨細胞的G418最小致死劑量的測定；MTT檢測基因轉染對滑膜細胞、軟骨細胞增殖的影響；RT-PCR檢測h

6、IL-1Ra和hIL-10基因在滑膜細胞、軟骨細胞中的表達；ELISA檢測滑膜細胞、軟骨細胞體外hIL-1Ra和hIL-10蛋白的表達。 3.不同目的基因轉染OA患者軟骨細胞前后差異表達基因的篩選：PLXRN、PLXRN-IL-1Ra和PLXRN-IL-10病毒轉染OA患者原代軟骨細胞；各組總RNA提取、純化及質檢；探針的合成、標記與純化；cDNA陣列膜的雜交；圖像的掃描和數(shù)據(jù)分析；差異表達基因的篩選。 結果：

7、1.質粒PcDNA3.1-IL-1Ra和PcDNA3.1-IL-10轉化、擴增后進行基因測序并與Genbank中的相應序列比對無誤；PLXRN-IL-1Ra經限制性內切酶EcoR-I切割后可釋放出約900bp大小的hIL-1Ra片段，PLXRN-IL-10經限制性內切酶Sal-I和Xho-I切割后可釋放出約1100bp大小的hIL-10片段,說明載體構建成功；PT67細胞包裝PLXRN、PLXRN-IL-1Ra和PLXRN-IL-10逆

8、轉錄病毒，NIH/3T3細胞測定病毒滴度分別為3.5×105、3×104 ,5×104 CFU/ml。 2.基因轉染滑膜細胞、軟骨細胞后，MTT檢測發(fā)現(xiàn)：滑膜細胞中，病毒轉染可抑制滑膜細胞的增殖，聯(lián)合基因轉染時抑制作用更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；軟骨細胞中，PLXRN-IL-1Ra基因轉染組在轉染后72h時間點對軟骨細胞增殖有抑制作用，而PLXRN-IL-10和PLXRN基因轉染組分別在72h和96h時間點有促進軟

9、骨細胞增殖的作用，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。除此以外，病毒轉染對軟骨細胞增殖基本無影響，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。RT-PCR檢測在第C、E組出現(xiàn)311 bp大小的IL-1Ra的mRNA片段，第D、E組有328 bp大小的IL-10的mRNA片段的表達。而A組和B組未見IL-1Ra和IL-10 mRNA的表達帶，GAPDH在各組均有表達。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)基因轉染組均有相應的一定量的hIL-1Ra和hIL-10表達?；?/p>

10、細胞中單個基因轉染組（C組和D組）中蛋白hIL-1Ra和hIL-10濃度分別為：（51.43±13.13）ng/l和(5.11±3.62）ng/l；聯(lián)合基因轉染組（E組）中分別為（46.37±5.85）ng/l和(6.35±3.02）ng/l；軟骨細胞中單個基因轉染組（C組和D組）中蛋白hIL-1Ra和hIL-10濃度分別為(60.47±15.13）ng/l和(19.73±4.10）ng/l；聯(lián)合基因轉染組（E組）為（67.15±11.

11、47）ng/l和(16.76±9.96）ng/l。A組及B組均無hIL-1Ra和hIL-10表達，單個或聯(lián)合基因轉染組（C、D、E組）與對照組（A、B組）比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而單個基因轉染組（C、D組）和聯(lián)合基因轉染組（E組）組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。 3.基因芯片檢測不同目的基因的單獨或聯(lián)合轉染前后的基因表達譜，篩選軟骨細胞中差異表達基因。以對照組PLXRN有效基因為參照，實驗組PLXRN-IL-

12、1Ra、PLXRN-IL-10、DT分別表達7個、17個和22個差異基因；以實驗組（PLXRN-IL-1Ra）有效基因為參照，實驗組(DT)表達8個差異基因；以實驗組（PLXRN-IL-10）有效基因為參照，實驗組(DT)表達14個差異基因。 結論： 1.利用新型復制缺陷型逆轉錄病毒載體（PLXRN）成功構建了含人IL-1Ra和IL-10的逆轉錄病毒表達系統(tǒng)PLXRN-IL-1Ra、PLXRN-IL-10。重組質粒轉染P

13、T67細胞后，該細胞內產生的外殼蛋白、核心蛋白與逆轉錄酶的組裝，能產生具有感染靶細胞能力并能介導IL-1Ra和IL-10基因轉移的重組逆轉錄病毒。 2.逆轉錄病毒載體PLXRN介導的hIL-1Ra和hIL-10聯(lián)合基因可有效地感染人OA膝關節(jié)第3代滑膜細胞和原代軟骨細胞并獲得穩(wěn)定表達。單獨基因轉染和聯(lián)合基因轉染其目的基因表達水平之間無顯著差異。所有病毒轉染組都有抑制滑膜細胞增殖的作用，聯(lián)合基因轉染時抑制作用更明顯。然而絕大多數(shù)病