以枯草桿菌芽孢呈遞系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新型流感疫苗基礎(chǔ)研究.pdf

1、目的:本研究利用枯草桿菌芽孢展示外源抗原的芽孢呈遞技術(shù),制備出表面展示流感病毒保守抗原M2蛋白胞外區(qū)(M2e)的重組芽孢,并作為流感病毒新型候選疫苗開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn),對(duì)其免疫原性及免疫保護(hù)效果進(jìn)行分析與評(píng)價(jià),為發(fā)展以枯草桿菌芽孢呈遞系統(tǒng)為基礎(chǔ)的新型流感疫苗奠定研究基礎(chǔ)。
　　方法:(1)將枯草桿菌CotB基因構(gòu)建到基因組整合質(zhì)粒pDG1664中,再將3個(gè)串聯(lián)的M2e分子基因連接到CotB基因的下游,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pDG1664-Cot

2、B-M2e3;通過(guò)同源重組的方式,將外源基因CotB-M2e3整合到PY79枯草桿菌基因組中。利用紅霉素抗性篩選重組菌并挑取重組子單菌落進(jìn)行培養(yǎng),提取基因組以PCR擴(kuò)增和測(cè)序方式鑒定是否正確整合了M2e抗原基因;通過(guò)SDS-PAGE、WesternBlot鑒定芽孢蛋白中流感病毒M2e抗原的表達(dá)情況,并采用流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光方法進(jìn)一步確定M2e抗原在芽孢表面的表達(dá)。利用形態(tài)學(xué)觀察、APICH50和API20E生化實(shí)驗(yàn)及16srRNA分析

3、等實(shí)驗(yàn)對(duì)重組芽孢的生長(zhǎng)狀態(tài)、生化特征等進(jìn)行了分析和鑒定。(2)為了進(jìn)一步分析表達(dá)流感M2e的重組芽孢的免疫原性和免疫保護(hù)性,我們應(yīng)用表達(dá)流感M2e的重組芽孢進(jìn)行動(dòng)物免疫和動(dòng)物攻毒實(shí)驗(yàn)。在不使用佐劑的情況下用重組芽孢直接口服免疫小鼠,首次連續(xù)口服免疫3天,待首次免疫4周后再連續(xù)免疫3天,之后于距首次免疫5周時(shí)進(jìn)行末次免疫,分別在首次免疫后5、7、9、11、13、15、17周尾靜脈采血并分離血清進(jìn)行體液免疫反應(yīng)的檢測(cè)和分析;同時(shí)利用流式細(xì)胞

4、術(shù)檢測(cè)細(xì)胞免疫水平;通過(guò)攻毒保護(hù)性試驗(yàn)對(duì)這種新型候選疫苗進(jìn)行免疫保護(hù)性評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:(1)表達(dá)流感病毒M2e的重組枯草桿菌芽孢的制備及鑒定:優(yōu)化條件后,采用電轉(zhuǎn)化方法將pDG1664-CotB-M2e3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至PY79感受態(tài)菌;轉(zhuǎn)化菌經(jīng)PCR檢測(cè)和基因測(cè)序鑒定表明,重組芽孢基因組中正確整合了M2e抗原基因。重組芽孢經(jīng)SDS-PAGE和WesternBlot分析證實(shí),流感病毒M2e抗原在重組芽孢中成功表達(dá);采用流式細(xì)胞術(shù)和

5、免疫熒光方法檢測(cè)進(jìn)一步確定了M2e抗原表達(dá)呈遞在重組芽孢表面,形成的重組芽孢表面蛋白(CotB-M2e融合蛋白)分子量約為37kDa。實(shí)驗(yàn)研究表明,我們成功制備出整合了M2e基因重組枯草芽孢菌株(命名RSM2e31)。利用電子顯微鏡檢測(cè)技術(shù)及重組芽孢傳代培養(yǎng),進(jìn)行重組芽孢形態(tài)學(xué)觀察和分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組菌株RSM2e31能與野生株一樣形成芽孢,并且外源基因能夠在重組桿菌芽孢中穩(wěn)定存在;對(duì)重組芽孢菌進(jìn)行的生化反應(yīng)(APICH50及API

6、20E)實(shí)驗(yàn)及16srRNA測(cè)序結(jié)果分析表明,重組株仍屬于枯草芽孢桿菌屬。重組芽孢的生長(zhǎng)狀態(tài)如菌落形成和生化反應(yīng)等雖然與野生枯草芽孢桿菌有稍許變化,但重組株的基本生化特性與野生株具有較好的一致性。
　　(2)表達(dá)流感病毒M2e的重組枯草桿菌芽孢免疫原性及免疫反應(yīng)特征分析:為了進(jìn)一步分析表達(dá)流感M2e的重組芽孢的免疫原性和觀察其免疫反應(yīng)特征,本研究采用口服免疫的方式免疫小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。小鼠免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,RSM2e31重組芽孢不

7、添加佐劑進(jìn)行口服免疫能夠誘導(dǎo)出良好的體液免疫應(yīng)答,并且免疫后17周抗體水平處于較高的水平(1:11200)?？贵w亞類(lèi)分析表明重組芽孢誘導(dǎo)的IgG抗體以IgG1為主。進(jìn)一步取免疫小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行的胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測(cè)發(fā)現(xiàn),RSM2e31重組芽孢免疫可以有效誘導(dǎo)M2e抗原特異性Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答。小鼠肺和腸灌洗液sIgA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),重組芽孢還能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一定的粘膜免疫應(yīng)答。
　　(3)表達(dá)流感病毒M2e的重組枯草桿菌芽孢疫苗的攻毒保

8、護(hù)性實(shí)驗(yàn)研究:采用A/PR/8/34(H1N1)流感病毒以103TCID50劑量對(duì)免疫后17周小鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。野生株芽孢免疫組、PBS對(duì)照免疫組小鼠的存活率僅為10％,而RSM2e31重組芽孢免疫小鼠全部存活。肺組織病毒滴度檢測(cè)發(fā)現(xiàn),RSM2e31重組芽孢免疫小鼠肺組織病毒滴度顯著降低,表明體內(nèi)病毒復(fù)制得到有效抑制。由此可見(jiàn),RSM2e31重組芽孢具有良好的免疫保護(hù)作用。
　　結(jié)論:本研究針對(duì)流感病毒M2e保守性抗原建立了