手足口病重要病毒序列分析及生物信息學(xué)表征.pdf

1、目的：手足口病是一種流行性傳染病，多由腸道病毒引起，癥狀主要表現(xiàn)為手、足和口腔粘膜的皰疹，多數(shù)是良性、自限性疾病，也可出現(xiàn)心、肺和神經(jīng)系統(tǒng)等嚴(yán)重并發(fā)癥。我們利用對(duì)腸道病毒具有較高特異性的兼并引物和自行設(shè)計(jì)的分型引物，檢測(cè)手足口病患兒咽拭子標(biāo)本，同時(shí)，通過(guò)腸道病毒基因組VP1編碼區(qū)序列的測(cè)定和分析，研究手足口病病原體檢測(cè)和分型方法，掌握其遺傳進(jìn)化特征。人類(lèi)腸道病毒屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，該屬包括脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、?？刹《竞?/p>

2、腸道病毒，其中腸道病毒71型是引起手足口病最重要的病原體，由其引起的手足口病癥狀較重，常伴有無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等并發(fā)癥，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致死亡。該病毒存在較明顯的變異和重組現(xiàn)象，因此到目前為止仍沒(méi)有很好的預(yù)防和治療方法。本課題通過(guò)對(duì)腸道病毒71型VP1區(qū)序列及全基因組序列的分析，研究腸道病毒71型的變異、重組規(guī)律，為疫苗的研發(fā)、藥物靶位的篩選及防控策略的完善等提供理論基礎(chǔ)。除柯薩奇病毒A16(CVA16)和腸道病毒7

3、1型(EV71)以外，柯薩奇病毒A10(CVA10)、柯薩奇病毒A6(CVA6)也是手足口病比較常見(jiàn)的病原體。本課題通過(guò)對(duì)手足口病CVA10 VP1蛋白的生物信息學(xué)研究，分析和預(yù)測(cè)該病毒VP1蛋白的理化特性、空間結(jié)構(gòu)以及該蛋白的B細(xì)胞抗原表位。
　　 方法：⑴標(biāo)本采集自山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院住院手足口病患兒的咽拭子標(biāo)本。標(biāo)本加入適當(dāng)生理鹽水，劇烈振蕩洗下咽拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，自然沉淀后吸取上清液，加入適量抗生素，置

4、4℃條件下，備用。⑵采用北京天根公司病毒RNA提取試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的RNA溶于60ulRnase-free ddH2O中，直接用于RT-PCR或置-20℃以下低溫保存。⑶用腸道病毒通用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR核酸檢測(cè)試劑盒同時(shí)分別進(jìn)行腸道病毒屬、EV71和CVA16型進(jìn)行分子鑒定。⑷合成對(duì)腸道病毒VP1區(qū)3’端序列具有較高特異性的兼并引物040-011，同時(shí)通過(guò)檢索GenBank中EV71和CVA10病毒基因型VP1序列，分別設(shè)計(jì)

5、分型引物。⑸通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增EV71、CVA16、CVA6和CVA10病毒基因型VP1區(qū)核苷酸序列。⑹瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離，利用北京天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)DNA進(jìn)行回收、純化。⑺回收后的DNA進(jìn)行序列測(cè)定。采用生物信息學(xué)軟件DNAMAN5.2.2和BioEdit7.0.9.0進(jìn)行序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。⑻使用基因重組分析軟件RDP和Simplot＿v3.5.1，對(duì)EV71基因組進(jìn)行重組分析。⑼利用R4

6、(Gamier-Osguthorpe-Robson方法)、HNN(Hierarchical人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)法)、PHD(多重比對(duì)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)比對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)法)、Predator(單序列分析人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)法)、SOPMA(改進(jìn)型自我優(yōu)化預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)法)等方法預(yù)測(cè)VP1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(無(wú)規(guī)卷曲、β-片層、β-螺旋和β-轉(zhuǎn)角)。⑽利用Expasy(http：//au.Expasy.org/tools/)中的SWISS-MODEL三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建

7、模，預(yù)測(cè)VP1蛋白的空間構(gòu)象并建模。⑾應(yīng)用DNAstar軟件的Protean，采用Kyte-Doolittle、Karplus-Schultz、Emini和Jameson-Wolf對(duì)氨基酸的親水性、柔韌性、表面可能性及抗原指數(shù)進(jìn)行單參數(shù)分析。⑿用ABCpred和DiscoTope服務(wù)器預(yù)測(cè)B細(xì)胞表位。將單參數(shù)預(yù)測(cè)結(jié)果匯總，結(jié)合二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲區(qū)域確定為B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位。最后采用ABCpred和DiscoTope驗(yàn)證表位預(yù)測(cè)結(jié)果。

8、　　 結(jié)果：①5個(gè)EV71濟(jì)南分離株核苷酸同源性為95.7％-99.1％，氨基酸同源性為98.7％-100％。在進(jìn)化關(guān)系上，它們與EV71 C4a亞型的同源性較高，核苷酸同源性為90.8％-98.8％，故而屬于C4a亞型。②2個(gè)CVA16濟(jì)南分離株核苷酸和氨基酸同源性較高，分別為97.7％和96.8％。它們與CVA16 B1b亞型的同源性較高，核苷酸和氨基酸的同源性分別為90.5％-95.5％和96.8％-100％。JN-C07和JN

9、-B11與大部分毒株相比，無(wú)氨基酸變異位點(diǎn)出現(xiàn)。③39份腸道病毒通用型陽(yáng)性非EV71、非CVA16標(biāo)本，用040-011引物擴(kuò)增后，有5例為CVA10，1例為CVA6。其余33份樣本的腸道病毒血清型待定。④利用自行設(shè)計(jì)的CVA10分型引物P16、P11.2擴(kuò)增上述33份血清型待定的標(biāo)本，其中4份標(biāo)本確定CVA10，核苷酸同源性為94.5％-99.0％，氨基酸同源性為97.2％-99.5％。⑤在線(xiàn)Blast程序比對(duì)，JN-D04屬于CVA

10、6型，與2003年，2009年報(bào)告的12個(gè)CVA6毒株核苷酸同源性為75.1％-92.3％，同源性最高的是臺(tái)灣2008年的EU908152，氨基酸同源性為82.0％-89.0％；氨基酸在767、773、776、777、792、806、812、824、827、841、843和845位發(fā)生變異。⑥2010年濟(jì)南市2個(gè)病毒株在P1區(qū)與EV71 C型具有較高相似度(Simplot圖中顯示相似度>80％)，在2B-3B區(qū)之間與B基因型相似度較高(

11、>75％)。3’末端這兩個(gè)病毒株與EV71各基因型代表株的相似度均不高(<75％)，而在3C到3’UTR區(qū)與CVA16 G-10相似較高(>75％)。⑦JN-C10與CVA10 D型基因組同源性最高，核苷酸和氨基酸的同源性分別為91.5％-97.6％和90.4％-98.6％。測(cè)序所得VP1基因長(zhǎng)為732個(gè)核苷酸，其相對(duì)分子質(zhì)量為60580，理論等電點(diǎn)為5.10。VP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中以無(wú)規(guī)卷曲為主，無(wú)跨膜區(qū)域，屬于胞外蛋白。發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)

12、庫(kù)(PDB)一個(gè)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)(編號(hào)為3vbhA)與VP1具有65％的序列一致性，并以此為模板，得到VP1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。最后，綜合多種抗原表位分析方法得出，JN-C10 VP1蛋白的B細(xì)胞抗原表位可能是12-23、100-110、115-125、169-180、195-215及220-2385個(gè)區(qū)段。
　　 結(jié)論：⑴兼并引物040-011對(duì)HEVA類(lèi)腸道病毒VP1區(qū)3’端具有較高的特異性。⑵引起手足口病的腸道病毒，除EV7

13、1和CVA16外，CVA10和CVA6也是其常見(jiàn)病原體。⑶CVA10能引起重癥手足口病和病毒性腦炎、癲癇等嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)。⑷2010年-2011年濟(jì)南EV71分離株為C4a亞型，CVA16分離株為B1b亞型，CVA10分離株為D基因型，與近幾年中國(guó)大陸各基因型優(yōu)勢(shì)株流行趨勢(shì)基本一致。⑸2010年EV71濟(jì)南分離株存在基因型內(nèi)和型間雙重組現(xiàn)象。⑹CVA10 VP1基因編碼蛋白存在多個(gè)抗原表位區(qū)域，可能是免疫診斷、藥物作用和疫苗研制的靶位，