黃瓜CCH基因的生物信息學(xué)及表達(dá)分析.pdf

1、本論文對(duì)黃瓜CCH基因的生物信息學(xué)進(jìn)行了分析包括氨基酸序列的比對(duì)、進(jìn)化樹(shù)分析、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、跨膜結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)預(yù)測(cè)、基因保守序列分析、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；同時(shí)通過(guò)RT-PCR分析明確該基因在不同組織以及Cu和鹽脅迫下的表達(dá)特性，該研究為今后進(jìn)一步研究該基因的功能和調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 一、黃瓜CCH基因的生物信息學(xué)分析 1通過(guò)BLASTp進(jìn)行了黃瓜CCH氨基酸序列的比對(duì)。 將黃瓜CCH氨基酸

2、序列提交到比對(duì)程序中，程序地址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp，經(jīng)過(guò)比對(duì)，挑選出15個(gè)與黃瓜CCH氨基酸序列相似性相對(duì)較高的序列。這些序列來(lái)源于擬南芥、番茄、馬鈴薯、水稻、大麥、楊樹(shù)、車(chē)前子、酵母、魚(yú)類(lèi)、犬類(lèi)、人類(lèi)。 2利用Treeview軟件進(jìn)行了進(jìn)化樹(shù)的繪制。 首先將與黃瓜CCH氨基酸序列同源性較高的15個(gè)序列輸入到clustalx程序中，生成phylip格式文件，用treevie

3、w程序進(jìn)行觀看上面生成的文件，即可得到進(jìn)化樹(shù)。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)的分析看出黃瓜的CCH基因在親緣關(guān)系上與擬南芥的Cu/Zn過(guò)氧化物歧化酶銅分子伴侶最近，其次，是白馬鈴薯的銅分子伴侶基因，從這一點(diǎn)可以推測(cè)，黃瓜CCH基因產(chǎn)物的功能可能側(cè)重于將銅運(yùn)輸?shù)紺u/Zn超氧化物歧化酶。 3利用Anthe軟件和expasytools進(jìn)行了黃瓜CCH蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，跨膜結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)。 將黃瓜CCH氨基酸的序列提交到http：//www.

4、cmpharm.ucsf.edu/～nomi/nnpredict.html網(wǎng)站中，預(yù)測(cè)該氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)a螺旋和β折疊交替的結(jié)構(gòu)。將黃瓜CCH氨基酸序列輸入到anthe軟件中，該軟件可以對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)出黃瓜CCH蛋白質(zhì)的疏水性、親水性、跨膜螺旋、溶解性、抗原性及等電點(diǎn)。將黃瓜CCH氨基酸序列提交到http：//sosui.proteome.bio.tuat.acjp/sosui_submit.htm

5、l網(wǎng)站中，預(yù)測(cè)黃瓜CCH蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)。黃瓜CCH氨基酸序列C末端的24個(gè)氨基酸HNGNFLFNA*GLYFLKLIIL*LYA是該蛋白質(zhì)的跨膜區(qū)域，其中主要氨基酸組成主要是F(苯丙氨酸)、Y(酪氨酸)、A(丙氮酸)、V(纈氨酸)、I(異亮氨酸)、L(亮氨酸)這些疏水氨基酸。 4分析了黃瓜CCH基因的保守序列。 將黃瓜CCH氨基酸序列提交到比對(duì)程序中，程序地址是ttp：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bl

6、astp，經(jīng)過(guò)比對(duì)后，結(jié)果顯示許多重金屬結(jié)合蛋白都有一個(gè)保守的重金屬相關(guān)結(jié)構(gòu)域(HAM，Heavy-metal-associateddomain)，該結(jié)構(gòu)域是由大約30個(gè)氨基酸組成的保守區(qū)域，在許多轉(zhuǎn)運(yùn)重金屬和消除重金屬毒性的蛋白質(zhì)中存在。 5利用expasytools進(jìn)行了黃瓜CCH蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。 將黃瓜CCH氨基酸序列以FASTA的格式提交到http：//www.cbs.dtu.dk/services/Targ

7、etP/，可以預(yù)測(cè)出黃瓜CCH基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明該基因產(chǎn)物可能在細(xì)胞中的各個(gè)組分中均有分布，分布在線(xiàn)粒體包括線(xiàn)粒體膜可能性最大，其次是葉綠體，再次是分泌系統(tǒng)。另外在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核中均有分布。 6利用SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)和Raswin軟件預(yù)測(cè)了黃瓜CCH蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。 將黃瓜CCH氨基酸序列提交到http：//swissmodel.expasy.org/網(wǎng)站中，該服務(wù)器將提交的氨

8、基酸序列生成PDB格式的文件；用raswin軟件進(jìn)行觀看，即可觀看到黃瓜CCH蛋白質(zhì)的三維成像圖。銅分子伴侶家族都有一個(gè)CXXC結(jié)構(gòu)域，即兩個(gè)半胱氨酸之間被插入的兩個(gè)其他的氨基酸所分開(kāi)，而且銅分子伴侶的三維結(jié)構(gòu)有一個(gè)βαββαβ模式，黃瓜的CCH蛋白也具有CXXC結(jié)構(gòu)域，其三維結(jié)構(gòu)也具有βαββαβ模式。 二、黃瓜CCH基因表達(dá)的分析 1黃瓜CCH基因的組織表達(dá)的RT-PCR分析。 分別提取14d株齡的黃瓜的葉片

9、、莖、根的RNA，通過(guò)RT-PCR反應(yīng)來(lái)檢測(cè)CCH基因在黃瓜葉片、莖、根中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示該基因在黃瓜葉片、莖、根均有表達(dá)。 2CuSO4處理后黃瓜CCH基因表達(dá)的RT-PCR分析。 分別用100μM，500μMCuSO4，對(duì)培養(yǎng)14d的黃瓜進(jìn)行灌根處理，設(shè)一組對(duì)照，在光照、25℃培養(yǎng)24h后，提取黃瓜葉片的RNA，通過(guò)RT-PCR來(lái)檢測(cè)在Cu處理后CCH基因在黃瓜葉片中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示對(duì)照及100μM的處理植株