腺相關(guān)病毒攜帶的骨保護素基因治療小鼠膝關(guān)節(jié)假體無菌性松動的實驗研究.pdf_第1頁
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1、第一部分 適于長期研究的小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動模型Pin-model的建立背景全關(guān)節(jié)置換是治療晚期關(guān)節(jié)炎常見而有效的治療方案。然而,將近34%的關(guān)節(jié)置換假體將會發(fā)生無菌性松動甚至失敗。因此無菌性松動成為假體置換的主要并發(fā)癥。 盡管假體松動的具體病理過程目前沒有研究清楚,但越來越多的研究表明,假體周圍磨損顆粒參與誘導(dǎo)的反應(yīng)在其中扮演著重要的角色。普遍認為,磨損顆粒激發(fā)了多樣的生物組織反應(yīng),包括骨假體表面血管肉芽組織的形成,炎癥

2、細胞聚集(如巨噬細胞和淋巴細胞的聚集),骨吸收,以及最終導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松和假體松動失敗。如何治療和預(yù)防關(guān)節(jié)假體松動成為目前該領(lǐng)域尚待解決的重大課題。 目的: 1.建立一種適于長期研究的小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動動物模型(Pin-model)2.探討假體松動的病理變化3.檢測基因治療方案的可行性方法1.小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動動物模型的構(gòu)建54只10-12周雌性小鼠,體重20g以上,分為鈦顆粒組(24只)、對照組(穩(wěn)定組,24只)和基因檢

3、測組(6只)。沿右膝關(guān)節(jié)旁縱行切開顯露脛骨平臺,垂直向髓腔鉆入約5mm,置入鈦釘。磨損顆粒實驗組,在術(shù)中鈦釘置入前注射至脛骨髓腔10μl,術(shù)后每月關(guān)節(jié)內(nèi)注射20μl的鈦顆粒。對照組則注射相同體積的PBS。 分別在術(shù)后2、4、12、24周處死小鼠,取材進行生物力學(xué)和組織形態(tài)學(xué)的檢測。 2.-AAV-LacZ外源病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)移將腺相關(guān)病毒編碼的LacZ-gene(AAV-LacZ)進行體內(nèi)轉(zhuǎn)移,檢測基因治療的可行性。術(shù)后4周,

4、將50μl的無菌培養(yǎng)液(含108IU/ml的AAV-LacZ)注射到每只小鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi),共計5只,對照組僅注射不含AAV-LacZ的培養(yǎng)液。7天后X-gal染色檢測AAV-LacZ病毒基因的轉(zhuǎn)移表達程度 3.Micro CT影像學(xué)檢查術(shù)后均立即進行Micro CT掃描,確定鈦釘?shù)奈恢檬欠裾_。每隔4周進行一次掃描,記錄鈦釘?shù)奈恢煤陀嬎忝劰堑墓敲芏?bone mineral density,BMD)。 4.鈦釘拔拉實驗(Pu

5、ll-out test)離斷膝關(guān)節(jié),顯露假體鈦釘帽,用定制的鋁桿與鈦釘帽連接,與Instron model8841機器相連。以2.0 mm/min進行牽拉,對輸出數(shù)據(jù)進行分析。 5.組織形態(tài)學(xué)檢測HE染色觀察鈦釘周圍的新生骨或骨質(zhì)破壞,以及鈦顆粒引起的炎癥反應(yīng),包括鈦釘周圍的軟組織形成和炎性細胞浸潤和破骨細胞的變化;Masson三色染色法檢測骨膠原的變化;免疫組化染色檢測致炎細胞因子IL-1,TNF;CD68檢測破骨前體細胞;X

6、-gal染色檢測外源基因的表達。 結(jié)論: 1.成功建立了小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動模型Pin-model,模擬了臨床磨損顆粒誘導(dǎo)的松動的過程,適合長期實驗研究 2.假體松動是一個慢性連續(xù)性的病理過程,伴隨炎癥細胞的浸潤,破骨細胞的活化,導(dǎo)致骨質(zhì)吸收,最終假體松動 3.AAV-LacZ病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)移表達成功,確保了基因治療的可行性 第二部分: AAV-OPG對磨損顆粒誘導(dǎo)的假體松動治療作用的實驗研究前

7、言關(guān)節(jié)假體松動是外科關(guān)節(jié)置換的最為常見并發(fā)癥之一。在所有引起關(guān)節(jié)假體松動的因素中,尤為重要的因素是磨損顆粒引起的周圍組織反應(yīng)。關(guān)節(jié)翻修手術(shù)經(jīng)常見到UHMWPE等材料的磨損顆粒,組織學(xué)檢查也證實了這一點。目前普遍認為機械運動產(chǎn)生的磨損顆粒,會被巨噬細胞吞噬,進而激活一系列的炎癥細胞,釋放炎癥因子和細胞因子,如IL-1,TNF,IL-6等。這些炎癥因子又會造成局部組織的炎癥反應(yīng),激活誘導(dǎo)破骨細胞至假體-骨界面。影響界面新骨的形成和重塑,導(dǎo)致

8、骨質(zhì)吸收,最終導(dǎo)致無菌性松動,手術(shù)失敗。 本實驗擬在已成功建立的Pin-model小鼠模型上,通過體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移技術(shù),將腺相關(guān)病毒AAV攜帶的編碼OPG基因(AAV-OPG)轉(zhuǎn)染到術(shù)肢內(nèi),進而檢測OPG基因治療方案的可行性和有效性。 目的: 1. 在新型Pin-model的基礎(chǔ)上,應(yīng)用AAV-OPG基因治療 2. 檢測AAV-OPG基因治療的有效性和可行性3. 探討AAV-OPG基因治療作用機制 方

9、法: 1.小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動動物模型的構(gòu)建54只10-12周雌性小鼠分為三組:AAV-OPG,鈦顆粒(Ti particle)和穩(wěn)定(Stable)組。鈦合金釘由Stryker Orthopaedic Inc.制備。鈦粒子Ti-6A1-4V,平均直徑0.53μm,AAV-OPG,由Chapel Hill提供。 2.Micro CT影像學(xué)檢查術(shù)后均立即進行Micro CT掃描,確定鈦釘?shù)恼_是否位置。每隔4周掃描一次,記錄鈦

10、釘?shù)奈恢煤陀嬎忝劰堑腂MD。 3.鈦釘Pull-out test離斷膝關(guān)節(jié),顯露假體鈦釘帽,用定制的鋁桿與鈦釘帽連接,與Instron:model8841機器相連。以2.0 mm/min進行牽拉,對輸出數(shù)據(jù)進行分析。 4.組織學(xué)和免疫組化檢測HE染色,觀察鈦釘周圍的新生骨或者骨質(zhì)破壞,以及鈦顆粒引起的炎癥反應(yīng),包括鈦釘周圍的組織形成和細胞浸潤及,TRAP染色檢測破骨細胞的變化。改良的Masson染色法檢測骨膠原的變化。免

11、疫組化染色檢測致炎細胞因子IL-1,TNF及CD68陽性細胞的表達。 5.Real-time PCR檢測OPG核酸水平變化切取包繞鈦釘?shù)囊欢蚊劰?,研磨提取RNA,分光光度計檢測260/280吸光度比值,計算RNA濃度,轉(zhuǎn)cDNA,進行real-time PCR,檢測OPG核酸變化。 6.酶連免疫吸附實驗ELASA檢測OPG蛋白水平變化切取包繞鈦釘?shù)囊欢蚊劰?,研磨離心提取蛋白,分光光度計檢測450吸光度值,計算蛋白濃度,檢

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