細(xì)胞介導(dǎo)的骨保護(hù)素基因治療對(duì)磨損顆粒導(dǎo)致的小鼠假體松動(dòng)作用的研究.pdf

1、第一部分磨損顆粒導(dǎo)致小鼠假體松動(dòng)的動(dòng)物模型的建立
　　 目的：
　　 調(diào)查建立適于長(zhǎng)期研究的小鼠假體松動(dòng)動(dòng)物模型的可行性,研究假體松動(dòng)的病理過程,并檢測(cè)基因治療的可行性。
　　 材料與方法
　　 1.動(dòng)物54只雌性八周齡的BALB/c小鼠作為假體松動(dòng)模型的宿主,分為鈦顆粒組(18只)、對(duì)照組(18只)和LacZ基因轉(zhuǎn)導(dǎo)組(18只)。實(shí)驗(yàn)開始之前隔離至少一周時(shí)間。
　　 2.假體松動(dòng)模型的建立小鼠麻

2、醉后在無菌條件下,沿左髕韌帶內(nèi)側(cè)縱行切開,顯露脛骨平臺(tái),刮除脛骨平臺(tái)軟骨,0.7mm的鉆頭從脛骨平臺(tái)中央垂直鉆入5mm,植入鈦釘,對(duì)于鈦顆粒組小鼠在植入鈦釘之前向脛骨髓腔注入10μl鈦顆粒懸浮液且術(shù)后每月注射20μl鈦顆粒懸浮液至關(guān)節(jié)腔,而對(duì)照組的小鼠髓腔則不注入鈦顆粒,以PBS代替。用含有青霉素和鏈霉素的PBS沖洗傷口后縫合,術(shù)后3、7、12周處死小鼠,進(jìn)行拔釘實(shí)驗(yàn)和組織學(xué)檢測(cè)。
　　 3.病毒載體和LacZ基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)移腺相

3、關(guān)病毒(AAV)為L(zhǎng)acZ基因的載體,以檢測(cè)基因治療的可行性。術(shù)后3周,將50pl無菌培養(yǎng)液(AAV-Lacz濃度為5×108IU/ml)注射到小鼠假體關(guān)節(jié)腔內(nèi),共計(jì)12只,其余6只注射不含病毒的培養(yǎng)液。術(shù)后7、12周處死小鼠行膝關(guān)節(jié)X-gal染色,檢測(cè)LacZ基因產(chǎn)物表達(dá)的效果。
　　 4.MicroCT測(cè)評(píng)應(yīng)用MicroCT觀察鈦釘植入的位置是否合適。手術(shù)當(dāng)天以及第3、7、12周各掃描一次。采集MicroCT圖像后對(duì)假體周圍

4、的脛骨骨密度(BMD)進(jìn)行測(cè)量。
　　 5.拔釘實(shí)驗(yàn)術(shù)后第3、7、12周處死小鼠,從假體關(guān)節(jié)處行膝關(guān)節(jié)離斷,去除假體周圍的軟組織顯露鈦釘帽,將假體及脛骨通過牙科粉置于固定架上,假體釘帽置于固定架的夾持刀片中間,將固定架與MTS機(jī)器相連,以2.0mm/min的速度進(jìn)行牽拉,并對(duì)輸出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。
　　 6.組織學(xué)和免疫組織學(xué)檢查拔釘實(shí)驗(yàn)后收集脛骨近端的組織。應(yīng)用福爾馬林緩沖液固定,12％EDTA脫鈣,石蠟包埋。蘇木精

5、-伊紅(HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察新生骨或者骨質(zhì)破壞,并使用Image-Pro軟件計(jì)算假體和脛骨之間界膜的厚度。改良的Masson三色染色法觀察骨膠原的變化。應(yīng)用免疫組織化學(xué)的抗生物素·生物素·過氧化物酶法(ABC法)檢測(cè)IL-1,TNFα和CD68的表達(dá)。X-gal染色檢測(cè)LacZ基因的表達(dá)。
　　 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS軟件包對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析并進(jìn)行多重比較。P<0.05表示具有顯著性差異。所有數(shù)值用平

6、均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立了小鼠膝關(guān)節(jié)假體松動(dòng)模型Pin-model,模擬了臨床假體磨損顆粒誘導(dǎo)松動(dòng)的過程。
　　 2.假體松動(dòng)是一個(gè)慢性持續(xù)性的過程,伴隨炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎性假膜的形成、破骨細(xì)胞的激活并導(dǎo)致骨質(zhì)破壞,最終形成假體松動(dòng)。
　　 3.AAV-LacZ病毒體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)成功,確保了基因治療的可行性。
　　 第二部分
　　 細(xì)胞介導(dǎo)的骨保護(hù)素基因治療對(duì)磨損

7、顆粒導(dǎo)致的小鼠假體松動(dòng)作用的研究
　　 目的：
　　 1.調(diào)查編碼OPG基因的腺相關(guān)病毒針對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(FLS)的體外轉(zhuǎn)染效率。
　　 2.在新Pin-model小鼠模型的基礎(chǔ)上,檢測(cè)FLS介導(dǎo)的OPG轉(zhuǎn)基因治療小鼠假體松動(dòng)的有效性和可行性。
　　 3.探討FLS-AAV-OPG體外基因治療的作用機(jī)制。
　　 材料和方法
　　 1.成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞將10只雌性八周齡的BA

8、LB/c小鼠引頸處死,酒精消毒雙下肢,顯露雙膝關(guān)節(jié)。剔除膝關(guān)節(jié)周圍的肌肉,收集膝關(guān)節(jié)周圍的滑膜組織,PBS沖洗后剪碎,放入含有1mg/ml原酶的RPMI1640培養(yǎng)液中,37℃孵育2小時(shí)。通過尼龍篩過濾、反復(fù)多次沖洗,將過濾液以1500轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心8分鐘,去除上清液,將FLS細(xì)胞放入含10％FBS和1％青霉素/鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng),放置在5％CO2培養(yǎng)箱,培育溫度37℃。第二天換液后繼續(xù)培養(yǎng),長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)按照1:

9、5比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。
　　 2.基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞編碼OPG基因的腺相關(guān)病毒和編碼LacZ的腺相關(guān)病毒針對(duì)FLS細(xì)胞進(jìn)行體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到30-40％時(shí),將50μl的109cfuAAV-OPG-GFP(或AAV-LacZ)和5ml新鮮培養(yǎng)液加入FLS細(xì)胞；37℃孵育8個(gè)小時(shí)后第二次加入同樣劑量的上述轉(zhuǎn)導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)。綠色熒光顯微鏡檢測(cè)OPG-EGFP基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；X-gal染色測(cè)定轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中LacZ基因的表達(dá)及轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。<

10、br>　　 3.假體松動(dòng)動(dòng)物模型的建立60只雌性八周齡的BALB/c小鼠分為五組:AAV-OPG,FLS-AAV-OPG,AAV-LacZ,FLS-AAV-LacZ和PBS對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)開始之前小鼠隔離至少一周時(shí)間。小鼠麻醉后在無菌條件下,沿左髕韌帶內(nèi)側(cè)縱行切開,顯露脛骨平臺(tái),刮除脛骨平臺(tái)軟骨,0.7mm直徑的鉆頭從脛骨平臺(tái)中央垂直鉆入約5mm,植入鈦釘,在植入鈦釘之前向脛骨髓腔注入10μl鈦顆粒懸浮液且術(shù)后4周注射20μl鈦顆粒懸浮液

11、至關(guān)節(jié)腔。術(shù)后第3周,將50μl分別含有AAV-OPG、AAV-LacZ的無菌培養(yǎng)液(106IU/ml),501d分別含有FLS-AAV-OPG、FLS-AAV-LacZ的培養(yǎng)液(106個(gè)/ml)及50μl的PBS注射到小鼠的左膝關(guān)節(jié)腔?；蛑委?周后處死小鼠,進(jìn)行生物力學(xué)、組織學(xué)及分子生物學(xué)的檢測(cè)。
　　 4.拔釘實(shí)驗(yàn)基因治療后4周處死小鼠,從假體關(guān)節(jié)處行膝關(guān)節(jié)離斷,去除假體周圍的軟組織顯露鈦釘帽,將假體及脛骨通過牙科粉置于固

12、定架上,假體釘帽置于固定架的夾持刀片中間,將固定架與NITS機(jī)器相連,以2.0mm/min的速度進(jìn)行牽拉,并對(duì)輸出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。
　　 5.組織學(xué)和免疫組織學(xué)檢查拔釘實(shí)驗(yàn)后收集脛骨近端的組織。應(yīng)用福爾馬林緩沖液固定,12％EDTA脫鈣,石蠟包埋。蘇木精.伊紅(HE)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察新生骨或者骨質(zhì)破壞,并使用Image-Pro軟件計(jì)算假體和脛骨之間界膜的厚度。改良的Masson三色染色法觀察骨膠原的變化。應(yīng)用免疫組織

13、化學(xué)的抗生物素-生物素-過氧化物酶法(ABC法)檢測(cè)IL-1,TNFα和CD68的表達(dá)。X-gal染色檢測(cè)LacZ基因的表達(dá)。
　　 6.TRAP染色檢測(cè)破骨細(xì)胞將脛骨近端組織的石蠟切片脫蠟后微波30秒,使用TRAP試劑盒對(duì)切片進(jìn)行固定和染色。假體周圍假膜細(xì)胞胞漿的紫色染色為TRAP陽性細(xì)胞。
　　 7.OPG轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)常規(guī)的RT-PCR檢測(cè)基因治療部位及其它遠(yuǎn)處器官中OPG基因的表達(dá)。PCR產(chǎn)物在1％的瓊

14、脂糖凝膠中進(jìn)行電泳觀察其大小。FLS-AAV-OPG培養(yǎng)液中OPG蛋白及左脛骨假體周圍組織中OPG蛋白的濃度使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)。
　　 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 SPSS軟件包對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析并進(jìn)行多重比較。P<0.05表示具有顯著性差異。所有數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
　　 結(jié)論：
　　 1.細(xì)胞介導(dǎo)的OPG基因在能夠在小鼠Pin-model內(nèi)成功表達(dá),能達(dá)到有效的治療濃度。