MALAT1對宮頸癌細胞生物學(xué)表型的影響.pdf

1、研究背景與目的：
　　近年來，宮頸癌發(fā)病率在某些地區(qū)有明顯上升趨勢，且患者年輕化趨勢越來越明顯。目前已明確宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，HPV)的持續(xù)感染相關(guān)，但有研究表明年輕婦女的HPV感染通常是一過性的，因此，在宮頸癌早期篩查中HPV檢測實驗不能很好的鑒別靜止和持續(xù)感染，再加上目前宮頸癌手術(shù)、放療和化療存在一定局限性，研究宮頸癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找新的能夠用于治療和病情監(jiān)測指標的靶分子成為

2、亟待解決的重大問題。
　　lncRNA是近年研究發(fā)現(xiàn)的在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達并廣泛參與幾乎所有生理和病理過程的一類非編碼RNA。實驗室前期在太空誘變宮頸癌細胞中篩選獲得一個表達上調(diào)的長片段非編碼RNA基因MALAT1，MALAT1是定位于染色體11q13，核酸序列為8708 bp，在多種腫瘤中被異常調(diào)控，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但MALAT1與宮頸癌的關(guān)系目前還未見其他實驗室有相關(guān)報導(dǎo)。本課題擬通

3、過RT-PCR方法檢測MALAT1在宮頸癌細胞系和宮頸上皮細胞樣本中的表達;用RNA沉默技術(shù)和過表達技術(shù)分別構(gòu)建干擾和過表達MALAT1的穩(wěn)定細胞系，從正反兩方面研究MALAT1對宮頸癌細胞生物學(xué)表型的影響;在此基礎(chǔ)上進一步對MALAT1影響宮頸癌細胞增殖的下游信號分子進行探索。
　　方法：
　　1.收集宮頸癌細胞系和宮頸上皮細胞樣本，提取RNA后，用RT-PCR的方法檢測MALAT1的表達，分析MALAT1的表達與宮頸癌的

4、相關(guān)性。
　　2.用MALAT1過表達載體pEGFP-C1轉(zhuǎn)染HaCat細胞和SiHa細胞，用MALAT1沉默載體pRNAT-U6.1/Neo轉(zhuǎn)染CaSki細胞，通過G418篩選和有限稀釋法建立穩(wěn)定的陽性細胞株。細胞增殖實驗、克隆形成實驗、劃痕修復(fù)實驗和Transwell實驗檢測MALAT1對宮頸癌細胞生物學(xué)表型的影響。
　　3.通過流式細胞術(shù)檢測MALAT1改變后細胞周期的變化，用RT-PCR的方法檢測影響細胞周期的相關(guān)分

5、子，分析MALAT1調(diào)控細胞增殖的相關(guān)分子。
　　結(jié)果：
　　1.MALAT1高表達于宮頸癌細胞系Hela、CaSki、SiHa、HCC94和宮頸病變上皮細胞樣本中，而在正常細胞HaCat和正常宮頸上皮細胞樣本中未檢測到MALAT1的表達，表明MALAT1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性。
　　2.經(jīng)雙酶切和測序鑒定，成功構(gòu)建MALAT1過表達載體pEGFP-C1/M1，將沉默載體和過表達載體分別轉(zhuǎn)染細胞后，成功建立MAL

6、AT1沉默和過表達穩(wěn)定細胞系;沉默MALAT1后，宮頸癌細胞生長速度減慢，克隆形成能力降低，細胞遷移能力下降;過表達MALAT1后細胞生長未出現(xiàn)明顯變化，細胞遷移能力增強。
　　3.MALAT1沉默后，G1期細胞增多，S期細胞減少，細胞周期蛋白cyclinD1、cyclinE、細胞周期蛋白依賴激酶CDK6表達明顯降低，CDK4沒有明顯變化，表明MALAT1通過調(diào)控G1/S期相關(guān)分子的表達影響宮頸癌細胞增殖。
　　結(jié)論：