長(zhǎng)鏈非編碼MALAT1對(duì)胰腺導(dǎo)管癌生物學(xué)功能影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、胰腺癌（PC）是目前全球備受關(guān)注的惡性腫瘤之一，因其具有惡性程度較高，轉(zhuǎn)移早，手術(shù)機(jī)會(huì)少，容易復(fù)發(fā)，死亡率高的特點(diǎn)，故有“癌中之王”之稱。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2015年P(guān)C死亡率位于我國(guó)癌癥死因第九位。根據(jù)美國(guó)國(guó)家癌癥中心預(yù)測(cè)，至2030年，PC將攀升至癌癥死因排行榜第二位。PC的90％以上為胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC），且PDAC患者術(shù)后五年中位生存時(shí)間小于6個(gè)月。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，盡管醫(yī)學(xué)診斷和治療手段有所提高，但PDAC患者的預(yù)后沒有明顯改善，

2、其五年生存率僅約7%。故對(duì)PDAC的深入研究的重要性不言而喻。
　　近年來，研究已證實(shí)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNAs）參與人類正常發(fā)育和異常的病理生理過程；與包括腫瘤在內(nèi)的人類多種疾病有極其密切的聯(lián)系，并通過多種方式調(diào)控癌癥的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后。轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1（MALAT1）是發(fā)現(xiàn)最早LncRNAs之一，位于染色體11q13.1上，轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)8708bp。研究發(fā)現(xiàn)MALAT1在人胰腺、肺等組織與其他正常組織相比較高表達(dá)；在非小

3、細(xì)胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌等癌組織中與癌旁組織相比呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與總生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)；并在腫瘤發(fā)展中，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等功能。然而在PDAC中MALAT1的研究甚少，其作用機(jī)制尚不清楚?因此，本課題將重點(diǎn)研究MALAT1在PDAC中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并在體外實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探討MALAT1對(duì)PDAC細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及其調(diào)控機(jī)制。
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)MALAT1 mRNA

4、在45例PDAC石蠟包埋組織（FFPE）和25例鄰近正常癌旁FFPE組織（ANT）中表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：MALAT1 mRNA在PDAC組織中表達(dá)水平明顯高于ANT，應(yīng)用原位雜交（ISH）發(fā)現(xiàn)MALAT1陽(yáng)性率在PDAC組織（77.8%，35/45）明顯高于ANT（32%，8/25）。采用qRT-PCR檢測(cè)胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞系PANC-1、MIAPACA-2、BXPC-3、CANPAN-1、ASPC-1和永生化HPDE6C-7細(xì)胞中MALA

5、T1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：與HPDE6C-7比較，MALAT1 mRNA表達(dá)水平在ASPC-1細(xì)胞中呈高表達(dá)；在BXPC-3、MIAPACA-2、CANPAN-1細(xì)胞中呈低表達(dá)；而在PANC-1細(xì)胞中無顯著差異。臨床病理參數(shù)分析，將45例PDAC FFPE組織按腫瘤大?。?4cm，≥4cm）、浸潤(rùn)深度（T1、T2和T3、T4）、腫瘤臨床分期（I、II和III、IV）進(jìn)行組間MALAT1 mRNA表達(dá)比較。結(jié)果顯示：MALAT1 m

6、RNA表達(dá)在腫瘤≥4cm組明顯高于腫瘤<4cm組（P=0.036）；浸潤(rùn)較深組（T3、T4）明顯高于浸潤(rùn)較淺組；臨床晚期組（III、IV）明顯高于臨床早期組（I、II），按MALAT1 mRNA平均值將45例PDAC分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，進(jìn)行相關(guān)性分析,其結(jié)果顯示：MALAT1表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、腫瘤臨床分期呈正相關(guān)（r=0.35，P=0.019；r=0.334，P=0.025;r=0.439，P=0.04）；而與患者性別、年齡

7、、腫瘤部位、組織分級(jí)、淋巴轉(zhuǎn)移、靜脈侵襲、神經(jīng)侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤血清CEA水平和腫瘤血清CA199等臨床因素?zé)o明顯相關(guān)性。
　　應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線顯示：MALAT1高表達(dá)組患者生存時(shí)間明顯短于低表達(dá)組患者生存時(shí)間（P=0.043）。單因素分析顯示：PDAC的發(fā)病部位（HR=2.103，95%CI：0.98-4.650，P=0.013）、腫瘤的浸潤(rùn)深度（HR=2.136，95%CI：0.999-4.965，

8、P=0.021）和MALAT1的表達(dá)水平（HR=1.505，95%CI:1.027-2.205，P=0.036）是獨(dú)立的預(yù)后因素。將單因素結(jié)果中P≤0.01的臨床參數(shù)納入Cox分析回歸模型分析顯示：PDAC的發(fā)病部位（HR=3.482，95%CI:1.414-8.547，P=0.007）、MALAT1 mRNA的表達(dá)水平（HR=1.798，95%CI:1.177-7.747，P=0.007）和神經(jīng)侵襲（HR=4.631，95%CI：1.

9、86-11.553，P=0.001）是獨(dú)立的預(yù)后因素。ROC曲線顯示：AUC為0.69（95% CI：0.561-0.829，P=0.009），cut-off值為0.1035；MALAT1在PDAC FFEP中診斷敏感性和特異性是分別為77.8%和60%?
　　在體外實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)MALAT1-shRNA慢病毒表達(dá)載體，經(jīng)陽(yáng)性克隆PCR鑒定、測(cè)序分析，結(jié)果顯示：針對(duì)MALAT1基因的4對(duì)shRNA鏈分別成功與質(zhì)粒pGLV3/H1/GF

10、P+Puro連接，成功構(gòu)建了慢病毒MALAT1-shRNA表達(dá)載體。經(jīng)包裝、純化、濃縮后產(chǎn)生的慢病毒滴度為1×108TU/mL。4對(duì)慢病毒MALAT1-shRNA轉(zhuǎn)染PANC-1和MIAPACA-2細(xì)胞的抑制率為分別14%~61%和17.5%~73.6%，其中MALAT1-5416，MALAT1-5543的抑制率下降最為明顯，抑制率為61%和73.6%；經(jīng)嘌呤霉素加壓篩選成功構(gòu)建了PANC-1和MIAPACA-2細(xì)胞MALAT1敲減穩(wěn)轉(zhuǎn)

11、株。通過qRT-PCR驗(yàn)證，PANC-1和MIAPACA-2細(xì)胞MALAT1敲除率分別為63%和72%。
　　細(xì)胞功能學(xué)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：敲除MALAT1后，PANC-1和MIAPACA-2組細(xì)胞增殖與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組相比明顯減慢。平板克隆實(shí)驗(yàn)顯示：敲除MALAT1后，PANC-1和MIAPACA-2細(xì)胞克隆形成能力明顯弱于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組。Transwell細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：敲除MALAT1后，

12、PANC-1和MIAPACA-2細(xì)胞遷移到濾膜下表面細(xì)胞數(shù)量明減少空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組；同時(shí)Transwell細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：敲除MALAT1后，PANC-1和MIAPACA-2細(xì)胞穿膜數(shù)量明顯少于空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PANC-1和MIAPACA-2早期凋亡率分別為26.93%3±1.74%、58.7%±4.4%，明顯高于各自空白對(duì)照組或陰性對(duì)照組。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)PANC-

13、1和MIAPACA-2與各自空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組DNA比例無明顯差異。在體內(nèi)，敲減MALAT1抑制PANC-1細(xì)胞的小鼠移植瘤生長(zhǎng)。
　　敲減MALAT1后，通過免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)通路蛋白，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：MIAPACA-2細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)錄因子FOS蛋白表達(dá)蛋白吸光度值下調(diào)49.4%，F(xiàn)GFR2的配體FGF2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，CAV1蛋白表達(dá)蛋白吸光度值上調(diào)310.1%?而PANC-1細(xì)胞FOS蛋白表達(dá)蛋白吸光度值下調(diào)3

14、0.6%，F(xiàn)GF2蛋白表達(dá)蛋白吸光度值上調(diào)67%；CAV1蛋白表達(dá)上調(diào)蛋白吸光度值74%。其他EGFR、ITGA6、VECFC、MET和RAP1等蛋白均無明顯變化。以上結(jié)果提示：MALAT1可能通過調(diào)節(jié)FOS/FGF2或CAV1等基因的表達(dá)而調(diào)控PDAC細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移、凋亡等生物學(xué)功能。
　　由于慢病毒介導(dǎo)MALAT1-shRNA敲減MALAT1，后期出現(xiàn)MALAT1基因回調(diào)，導(dǎo)致MALAT1敲減率不穩(wěn)定。因此，本研究應(yīng)用

15、CRISPR/Cas9技術(shù)在直腸癌HCT116WT二倍體細(xì)胞探索敲除和激活非常編碼MALAT1體系。該技術(shù)是目前能克服其他轉(zhuǎn)染方法（siRNA、shRNA）干擾效率較低、靶基因晚期上調(diào)、脫靶的效應(yīng)及TALEN激活體系的缺陷。本研究首次構(gòu)建dual-gRNA MALAT1的敲除載體和dCas9-sgRNA激活MALAT1的過表達(dá)載體，并成功構(gòu)建攜帶MALAT1基因特異性CRISPR/Cas9敲除和激活穩(wěn)轉(zhuǎn)株；dual-gRNA敲除MALA

16、T1，敲除率達(dá)99%；dCas9sgRNA激活MALAT1，MALAT水平增加500%-700%。同時(shí)，在體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：CRISPR/Cas9敲除MALAT1和激活MALAT1后，HCT116WT細(xì)胞增殖克隆形成能力與對(duì)照組相比分別被抑制和增強(qiáng)；CRISPR/Cas9敲除和激活MALAT1后，twist和snail mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照組相比分別降低和增加；MALAT1挽救實(shí)驗(yàn)顯示：twist、snail的mRNA表達(dá)水平高于對(duì)

17、照組相。最后經(jīng)TNFa誘導(dǎo)MALAT1敲除HCT116WT細(xì)胞，敲除組MALAT1P65蛋白水平無變化，而對(duì)照組P65蛋白水平增高。這些提示敲除MALAT1后，可能致NF-kB通道失活和導(dǎo)致核內(nèi)twsitsnail定位減少，從而抑制HCT116wt細(xì)胞增殖和遷移。
　　總之，MALAT1在PDAC組織中和部分細(xì)胞高表達(dá)；其表達(dá)與腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、腫瘤臨床分期病情進(jìn)展因素呈正相關(guān)；MALAT1表達(dá)與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)；MALAT1有

18、潛在作為病情評(píng)估的指標(biāo)，是獨(dú)立的預(yù)后因素。在體外，敲減MALAT1后，PDAC細(xì)胞增殖能力和克隆能力減弱；遷移、侵襲能力降低，抗凋亡能力減弱。在體內(nèi)，敲減MALAT1，PANC-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。敲減MALAT1后，PDAC細(xì)胞中FOS蛋白表達(dá)水平下降和CVA1及FGR2的蛋白水平表達(dá)增加，由此推測(cè)：MALAT1可能通過調(diào)節(jié)FOS/FGF2或CAV1等基因的表達(dá)來激活ERK/MAPK信號(hào)通路，從而調(diào)控PDAC細(xì)胞生長(zhǎng)?侵襲?遷移和凋亡。同