阿爾茨海默病中β淀粉樣前體蛋白羧基端短肽C31與自噬的相關性研究.pdf

1、目的：
　　阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病機制尚未明確，目前主流的觀點包括Aβ和Tau蛋白學說。然而β淀粉樣前體蛋白(APP)除了產生Aβ外，尚可產生其它的多肽片段而參與AD的發(fā)病，這其中包括APP羧基端片段C31。C31是經由Caspase在APP第664位位點剪切后產生的短肽，其包含了31個氨基酸片段。已有研究表明，C31具有潛在的神經毒性作用，與AD密切相關。自噬，作為細胞內一種清除不必要的或功能失調的細胞組分的基本代謝途徑，在

2、AD發(fā)病過程中同樣扮演著重要的角色。本研究首次探討了C31的毒性作用和自噬的關系，以及自噬是否介導C31的清除。
　　方法：
　　首先構建了p3xFLAG-CMV-10-mCherry(Vector)質粒，然后以此質粒為載體構建了p3xFLAG-CMV-10-mCherry-C31(C31)目的質粒。采用脂質體轉染法轉染入不同的細胞系中，并通過蛋白印跡方法(western blot)分別在不同細胞細胞系，包括SH-SY5Y和

3、APPsw穩(wěn)轉的HEK293細胞(APPsw HEK293)中驗證其表達；采用四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法檢測C31和對應的空載質粒瞬時轉染入SH-SY5Y和APPsw HEK293細胞48 h后的細胞存活率；分別予促自噬(Rapamycin和Starvation)，下調自噬(3-MA)以及加入自噬溶酶體抑制劑(CQ和NH4Cl)作用于細胞，采用western blot方法檢測自噬相關蛋白(LC3)水平和C31水平。最后，通過免疫共沉

4、淀法，檢測C31是否可以和LC3結合，并且采用免疫熒光方法檢測C31在細胞內的位置，觀察其是否可以與LC3共定位，以進一步驗證自噬是否是介導C31降解的關鍵途徑。
　　結果：
　　在SH-SY5Y和APPsw HEK293細胞系中，C31質粒轉染組細胞活力顯著低于空載體質粒轉染組(P<0.05)。在SH-SY5Y和APPsw HEK293細胞中，轉染C31組和對照組相比，自噬水平無明顯差異；促自噬情況下(Rapamycin和

5、Starvation)，LC3-II的水平比未加藥處理組略增高，但未達到統(tǒng)計學意義，C31水平相對于空載水平無統(tǒng)計學差異；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)作用于APPsw HEK293細胞后，LC3-II水平有輕度降低，但未達到統(tǒng)計學意義，C31水平相對于空載水平也未達到統(tǒng)計學意義；加入自噬體和溶酶體融合抑制劑，也即終末抑制劑，氯喹(CQ)和氯化銨(NH4Cl)后，細胞自噬的水平相對于未加藥處理組，有明顯的增高，且CQ的作用最為明顯

6、，C31水平相對于空載水平明顯增高。在SH-SY5Y細胞中，結果類似，但CQ和NH4Cl作用后，C31水平相對于空載水平無統(tǒng)計學差異。C31能夠促使SH-SY5Y和APPsw HEK293細胞中APP表達水平升高。C31通過與自噬相關蛋白LC3結合，從而錨定到自噬體上，而參與到自噬代謝過程。
　　結論：
　　C31在SH-SY5Y細胞和APPsw HEK293細胞中均能產生明顯的細胞毒性作用。過表達C31能夠促進細胞中APP