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1、目的:擬通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的技術(shù)(磷酸鈣DNA共沉淀法和vigofect真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑),建立包裝重組AAV的技術(shù)平臺,并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建攜帶人β淀粉樣肽單鏈抗體的基因scFv的重組腺相關(guān)病毒,為阿爾茨海默病的治療提供新的實(shí)驗(yàn)手段。試驗(yàn)的理論基礎(chǔ)主要來自兩大AAV包裝技術(shù)原理:rAAV-Helper free system和rHSV-RC感染包裝細(xì)胞系統(tǒng)。 第一部分:外源基因轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法的摸索。 方法:攜帶報告基因綠色熒
2、光蛋白的質(zhì)粒pSNAV2.0-EGFP作為外源基因,比較磷酸鈣共沉淀法和vigofect陽離子非脂質(zhì)體高效真核轉(zhuǎn)染試劑在:HEK293T細(xì)胞和Hela細(xì)胞、LA795細(xì)胞的瞬時表達(dá),以尋找一種經(jīng)濟(jì)高效的轉(zhuǎn)染方法。 結(jié)果:磷酸鈣共沉淀法和vigofect同步轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,2天后熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞數(shù)量,計(jì)算轉(zhuǎn)染效率4μg質(zhì)粒磷酸鈣法效率為49%,vigofect法效率為61%;磷酸鈣共沉淀法和vigofec
3、t同步轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后,計(jì)算轉(zhuǎn)染效率磷酸鈣法為17%,vigofect法為42%;磷酸鈣共沉淀法和vigofect同步轉(zhuǎn)染LA795細(xì)胞后,轉(zhuǎn)染效率磷酸鈣法為3%,vigofect法為13%。 結(jié)論:HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率是最高的,磷酸鈣法可達(dá)到約50%,威格拉斯試劑更高些,而LA795細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率最低。 第二部分:pSNAV2.0-EGFP轉(zhuǎn)染小鼠肺癌LA795穩(wěn)定細(xì)胞系的建立。經(jīng)磷酸鈣共沉淀法將pSNAV2.
4、0-EGFP轉(zhuǎn)入LA795細(xì)胞,2天后加入600μg/μl的G418抗生素篩選,抑制沒有轉(zhuǎn)入或者沒有穩(wěn)定轉(zhuǎn)入外源基因的細(xì)胞生長,經(jīng)過2周的篩選后,僅剩下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達(dá)EGFP的細(xì)胞,通過有限稀釋法,將這些細(xì)胞盡量以單細(xì)胞分入96孔板繼續(xù)培養(yǎng),并加入300μg/μl的G418維持濃度。當(dāng)細(xì)胞分裂增長呈克隆后,再轉(zhuǎn)入48孔板繼續(xù)培養(yǎng),繼而轉(zhuǎn)入24孔板,6孔板,最后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSNAV2.0-EGFP的小鼠肺癌LA795細(xì)胞系; 結(jié)論
5、:經(jīng)過磷酸鈣共沉淀法聯(lián)合G418抗生素的篩選,可以得到穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞系,該株細(xì)胞可作為包裝細(xì)胞系,用于重組腺相關(guān)病毒的包裝。 第三部分: AAV2.0-EGFP和.AAV2.0-VEGF-IRES-EGFP的包裝和純化。以rAAV-Helper free system為生產(chǎn)平臺,以Stregene公司的pHelper和pAAV-RC為輔助質(zhì)粒,聯(lián)合pSNAV2.0-EGFP,采用磷酸鈣法三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的技術(shù)將三個質(zhì)粒轉(zhuǎn)入H
6、EK293T細(xì)胞中,3天后搜集純化病毒,測定病毒生物滴度。結(jié)論:以Stregene公司的pHelper和pAAV-RC為輔助質(zhì)粒,加上本元正陽公司的載體質(zhì)粒pSNAV2.0-EGFP,利用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的方法可以成功包裝出有生物活性的重組腺相關(guān)病毒顆粒,經(jīng)過初步純化后可用于細(xì)胞試驗(yàn)。 第四部分:AAV2.0-Aβ-scFv的包裝和純化。pHelper、pAAV-RC、pSN?AV2.0-A β-scFv共同轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞中,
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