Bufalin通過抑制mTOR-P70S6K通路的活化誘導(dǎo)ECA109細(xì)胞凋亡.pdf

1、食管癌是由食管鱗狀上皮或腺上皮的異常增生所形成的惡性病變。我國是食管癌的高發(fā)國家，其最常見的組織學(xué)類型是鱗狀細(xì)胞癌。目前對食管癌采取多種治療方法，主要是手術(shù)輔助放化療，但由于其早期癥狀不明顯，不易察覺，病人就診時(shí)部分已是中晚期，故預(yù)后不佳。大量分子生物學(xué)研究資料表明，食管癌的發(fā)生發(fā)展是多階段、多基因參與的過程，并且存在信號通路異?；罨跋嚓P(guān)蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。因此，進(jìn)一步研究抗腫瘤藥物對食管癌的影響及有關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化，依然是食管癌治療

2、研究的目標(biāo)。
　　多個(gè)研究報(bào)道證明，Akt/mTOR/P70S6K(70kDa ribosomal protein S6kinase)信號傳導(dǎo)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中存在異常的激活。Akt/mTOR被認(rèn)為是蛋白質(zhì)合成的主要信號調(diào)節(jié)通路，參與細(xì)胞增殖、分化、遷移等調(diào)節(jié)。mTOR是一種多功能激酶，參與許多重要細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，其活化磷酸化P70S6K可促進(jìn)mRNA翻譯，生成細(xì)胞周期跨越G1期所必需的各種蛋白，抑制mTOR可致P70S6K磷酸

3、化受阻，進(jìn)而抑制翻譯進(jìn)程，使細(xì)胞周期停滯并誘導(dǎo)凋亡。
　　Bufalin是一種毒性配基，提取于中藥蟾酥，來源于黑眶蟾蜍和中華大蟾蜍耳后、皮膚腺分泌之漿液，屬蟾毒甾烯類化合物。國內(nèi)外研究顯示，它可以誘導(dǎo)多種白血病細(xì)胞和一些實(shí)體瘤細(xì)胞凋亡，并下調(diào)Bcl-2、c-myc、WT-1等腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。但其誘導(dǎo)凋亡的確切機(jī)制仍不清楚。
　　目前關(guān)于蟾蜍靈誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究很少，本實(shí)驗(yàn)以食管癌ECA109細(xì)胞為模型，觀察Bu

4、falin抑制mTOR/P70S6K通路的活化，從而誘導(dǎo)ECA109細(xì)胞凋亡，以探討其可能的機(jī)制。
　　目的:探討B(tài)ufalin通過抑制mTOR/P70S6K通路的活化誘導(dǎo)ECA109細(xì)胞凋亡過程中的作用。
　　方法:
　　1將攜帶高活性mTOR基因質(zhì)粒wtmTOR轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增，并使用脂質(zhì)體法將wtmTOR成功轉(zhuǎn)染到食管癌ECA109細(xì)胞中，Western Blot方法分別檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒0h、12h、

5、24h、30h、36h、42h、48h后細(xì)胞內(nèi)P70S6K的蛋白表達(dá)及其磷酸化水平(p-P70S6K)的變化，并得出轉(zhuǎn)染的最佳時(shí)間。
　　2用Western Blot方法分別檢測60 nmol/l Bufalin作用于ECA109細(xì)胞2h、6h、12h、24h、36h、48h后細(xì)胞內(nèi)cIAP-1、BAD的蛋白表達(dá)。
　　3用Western Blot方法分別檢測不同處理組（對照組、空載體轉(zhuǎn)染組、wtmTOR轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染后加Bu

6、falin組）細(xì)胞內(nèi)P70S6K、p-P70S6K、cIAP-1及BAD的蛋白的變化，進(jìn)而研究轉(zhuǎn)染wtmTOR質(zhì)粒及Bufalin對mTOR通路和細(xì)胞凋亡的影響。
　　4采用流式細(xì)胞儀通過PI染色進(jìn)行細(xì)胞周期解析及凋亡判定。
　　5用TUNEL標(biāo)記法檢測細(xì)胞的凋亡指數(shù)。
　　6采用倒置顯微鏡及Gimsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　　1成功將wtmTOR質(zhì)粒擴(kuò)增并轉(zhuǎn)染到食管癌細(xì)胞中，檢測其下游基因

7、的蛋白表達(dá)。
　　(1) P70S6K在轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后蛋白水平無明顯變化（0.599±0.011，0.594±0.013,0.606±0.012,0.608±0.010,0.592±0.017,0.599±0.021,0.600±0.036，P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2) p-P70S6K隨轉(zhuǎn)染后時(shí)間的增加(0h、12h、24h)表達(dá)量逐漸升高，至24h達(dá)到最高值，此后(30h、36h、42h、48h)開始下

8、降（0.389±0.013，0.411±0.019,0.609±0.016,0.573±0.015,0.394±0.013,0.383±0.006,0.262±0.018，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2 Western Blot檢測60 nmol/l Bufalin作用于ECA109細(xì)胞2h、6h、12h、24h、36h、48h后細(xì)胞內(nèi)cIAP-1和BAD的蛋白表達(dá)變化。
　　(1) cIAP-1的蛋白水平逐漸

9、降低(0.542±0.003，0.517±0.007，0.455±0.002，0.414±0.004，0.369±0.026，0.218±0.015，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2) BAD的蛋白水平逐漸升高（0.456±0.009，0.659±0.042，0.750±0.023，0.813±0.019，0.937±0.013，1.047±0.013，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3 Wester

10、n Blot結(jié)果顯示不同處理組間細(xì)胞內(nèi)P70S6K、p-P70S6K、cIAP-1和BAD的蛋白表達(dá)變化。
　　(1) P70S6K的蛋白水平在不同處理組間無明顯差別（0.901±0.045，0.914±0.023，0.900±0.020，0.898±0.022，P＞0.05），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2) p-P70S6K的蛋白水平在wtmTOR轉(zhuǎn)染組的表達(dá)明顯高于對照組和空載體轉(zhuǎn)染組，當(dāng)轉(zhuǎn)染后加入Bufalin2h，p

11、-P70S6K蛋白水平又受到抑制，明顯下降(0.761±0.085，0.766±0.068，0.952±0.059，0.762±0.019，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(3) cIAP-1的蛋白水平在wtmTOR轉(zhuǎn)染組的表達(dá)明顯高于對照組和空載體轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后加入Bufalin24h，cIAP-1蛋白水平又受到抑制，明顯下降(0.721±0.019，0.731±0.248，0.840±0.010，0.742±0.02

12、1，P＜0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(4) BAD的蛋白水平在wtmTOR轉(zhuǎn)染組的表達(dá)低于對照組和空載體轉(zhuǎn)染組，當(dāng)轉(zhuǎn)染后加入Bufalin24h，BAD蛋白水平又明顯升高（0.929±0.046，0.944±0.060，0.779±0.182，1.029±0.049，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示:
　　(1)0、20、40、60、80、100 nmol/l Bufalin處理

13、ECA109細(xì)胞24h，細(xì)胞凋亡率逐漸升高(3.01±0.317％，3.67±0.306％，6.74±0.198％，7.59±0.340％，18.22±0.651％，28.60±1.737％，P＜0.05);并出現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，G2/M期細(xì)胞百分比由對照組的9.24±1.919％增加至70.5±2.934％，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)流式細(xì)胞儀檢測不同處理組細(xì)胞凋亡率，wtmTOR轉(zhuǎn)染組的凋亡率明顯低于對照組和空載體

14、轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染后加入Bufalin24h，細(xì)胞凋亡率又明顯升高（5.60±0.411％，5.46±0.341％，4.19±0.210％，10.12±0.325％，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5 TUNEL標(biāo)記法顯示:細(xì)胞核棕黃色著染者為凋亡細(xì)胞，而正常細(xì)胞的胞核不著染。0、20、40、60、80、100 nmol/l Bufalin處理ECA109細(xì)胞24h，凋亡指數(shù)隨用藥濃度增加逐漸升高（2.13±0.431％，5.

15、56±1.345％，7.87±1.443％，15.17±2.657％，36.69±2.986％，50.98±2.978％，P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　6 Bufalin作用于ECA109細(xì)胞后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變
　　(1)倒置顯微鏡觀察:隨著藥物作用時(shí)間的延長，可見細(xì)胞皺縮，由多角形變?yōu)閳A形，細(xì)胞表面逐漸凸起小膜泡，細(xì)胞不斷地脫落懸浮于培養(yǎng)液中?；罴?xì)胞數(shù)量明顯減少，死亡細(xì)胞增多。
　　(2) Gimsa染色

16、觀察:Bufalin作用于ECA109細(xì)胞24h后，出現(xiàn)典型的凋亡改變，表現(xiàn)為細(xì)胞膜完整，胞漿中出現(xiàn)空泡、核染色質(zhì)濃縮、碎裂成塊彌散在細(xì)胞漿中，并可見膜結(jié)構(gòu)包裹的凋亡小體。同時(shí)可見少量壞死細(xì)胞，細(xì)胞輪廓不清，細(xì)胞核溶解消失。
　　結(jié)論:
　　1 Bufalin以時(shí)間依賴性方式促進(jìn)BAD的表達(dá)，抑制cIAP-1蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)食管癌ECA109細(xì)胞凋亡。
　　2 Bufalin通過抑制mTOR/P70S6K通路的活化誘