AMPK-p70s6k信號通路在布魯菌誘導巨噬細胞自噬中的作用研究.pdf

1、布魯菌?。˙rucellosis）是由布魯菌（Brucella）感染引發(fā)的一種人畜共患傳染性疾病。布魯菌為革蘭染色陰性的兼性胞內寄生菌，巨噬細胞是其生存和繁殖的靶細胞，它主要通過抑制細胞凋亡、促進細胞自噬得以在宿主細胞內長期生存繁殖。已有研究表明AMPK/p70s6k信號通路不僅參與細胞凋亡、自噬等多種細胞活動，還與病原體在細胞內的生存繁殖密切相關。
　　目的：
　　本研究擬通過建立羊種布魯菌16M（16M）體外感染小鼠巨噬

2、細胞RAW264.7（RAW264.7）實驗模型，探討AMPK/p70s6k信號通路對布魯菌胞內生存繁殖以及布魯菌介導細胞自噬的影響，從而揭示布魯菌在宿主細胞內的持續(xù)感染與AMPK/p70s6k信號通路密切相關。
　　方法：
　　1.建立16M體外感染RAW264.7細胞的實驗模型，應用Western blot技術檢測不同時間段RAW264.7細胞內p-AMPK(Thr172)和p-p70s6k(Thr389)的表達量變化。

3、
　　2. AMPK抑制劑Compound C（CC）與RAW264.7細胞共同孵育1h，然后，用16M侵染RAW264.7細胞，未經Compound C處理的細胞作為對照組，感染4h、8h、12h、24h和48h后通過布魯菌的CFU計數檢測布魯菌胞內存活情況；Western blot技術檢測AMPK抑制劑Compound C對16M介導RAW264.7細胞內p-AMPK(Thr172)和p-p70s6k(Thr389)表達的抑制

4、效果。
　　3.抑制劑Compound C與RAW264.7細胞共同孵育1h，然后，用16M侵染RAW264.7細胞，未經抑制劑Compound C處理的細胞作為對照組，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot檢測自噬相關基因LC3-II/LC3-I轉換率、Beclin1和ULK1的表達。
　　4.采用小分子干擾RNA(siRNA)軟件設計3對針對AMPKα2基因不同位點的siRNA片段，由公司合成

5、此siRNA片段，將特異性siRNA經轉染試劑siRNA-mate介導轉染至RAW264.7細胞內，24h后收集細胞，分別采用qRT-PCR和Western blot技術檢測AMPKα2的 mRNA和蛋白表達情況，分析對應不同位點的三對特異性siRNA片段對AMPKα2的沉默效果，篩選出實驗所需干擾效果最好的AMPKα2-siRNA片段。
　　5.將干擾效果最好的siRNA片段轉染至RAW264.7細胞內，6h后用16M侵染RAW

6、264.7細胞，未轉染AMPKα2-siRNA片段的細胞和轉染陰性對照片段（NC）的細胞作為對照組，利用CFU計數法檢測16M在RAW264.7細胞內的生存繁殖能力；利用qRT-PCR和Western blot技術分別檢測自噬相關基因Beclin1和ULK1的mRNA和蛋白表達水平。
　　結果：
　　1.16M侵染RAW264.7細胞后，p-AMPK(Thr172)在第2h表達量最高（P<0.05），在第8h、12h和24h

7、其表達水平恢復正常，與對照組相比無顯著差異（P>0.05），p-p70s6k(Thr389)的表達量在各時間點均低于對照組（P<0.05），自噬相關蛋白Beclin1和ULK1的表達顯著高于對照組（P<0.05）。
　　2.在4h、8h、12h、24h和48h，經抑制劑Compound C處理過的RAW264.7細胞內16M數目顯著低于對照組細胞（P<0.05）。
　　3.在12h和24h，16M+CC組細胞中的p-AMPK

8、(Thr172)、LC3-II/LC3-I轉換率、Beclin1和ULK1的蛋白水平顯著低于16M組細胞（P<0.01），p-p70s6k(Thr389)的蛋白表達高于16M組細胞（P<0.01），16M+CC組細胞中Beclin1和ULK1的mRNA相對表達量顯著低于16M組細胞（P<0.01）。
　　4.與正常組、siRNA-mate組和NC組相比，構建的特異性siRNA片段能有效降低RAW264.7細胞內AMPK的mRNA和

9、蛋白表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。對應不同位點的三對siRNA片段，其中AMPKα2-865-siRNA對AMPK mRNA和蛋白表達量的抑制效果最強。
　　5.分別在12h和24h，沉默AMPKα2基因細胞組內16M數目顯著低于空白對照組和NC細胞組（P<0.01）；沉默AMPKα2基因后，分別在12h和24h細胞內的p-AMPK(Thr172)、LC3-II/LC3-I的轉換率、Beclin1和ULK1的蛋白水

10、平顯著低于16M組細胞（P<0.01），p-p70s6k(Thr389)的蛋白表達高于16M組細胞（P<0.01），Beclin1和ULK1的 mRNA相對表達量顯著低于16M組細胞（P<0.01）。
　　結論：
　　1.布魯菌16M可以激活RAW264.7細胞內的AMPK/p70s6k信號通路。
　　2.抑制劑Compound C可顯著降低16M在RAW264.7細胞內的存活。
　　3.抑制劑Compound