氧化低密度脂蛋白通過Akt-mTOR-p70S6K途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬.pdf

1、研究目的：
　　自噬是一個(gè)在生物進(jìn)化上相對(duì)保守的過程，涉及長(zhǎng)壽蛋白的降解；它在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、穩(wěn)態(tài)平衡中發(fā)揮了重要的作用。氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)自噬活動(dòng)的發(fā)生，從而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)受損及有害物質(zhì)的降解。在我們的研究中，主要探討氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）自噬中的作用及其對(duì)Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)通路的影響。
　　研究方法：
　　傳代培養(yǎng)HUVECs，選用透氣的細(xì)胞培養(yǎng)瓶、DMEM

2、培養(yǎng)基（含10%胎牛血清+100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素），細(xì)胞呈現(xiàn)出貼壁生長(zhǎng)狀態(tài)，放置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24小時(shí)后換液繼續(xù)培養(yǎng)，并注意觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，約兩天傳一代，選用第四代HUVECs，以10*10^4/ml的細(xì)胞密度接種于六孔板中，每個(gè)孔內(nèi)接種2ml，然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將培養(yǎng)的HUVECs分為ox-LDL組和對(duì)照組，分別加入100ug/ml ox-LDL和等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS），培

3、養(yǎng)6h、12h后,收集細(xì)胞，應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察自噬體，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）方法檢測(cè)LC3、p62 mRNA表達(dá)水平；蛋白質(zhì)印跡法(免疫印跡試驗(yàn))即Western Blot方法檢測(cè)LC3、p62、P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR、P-p70S6K/p70S6K蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：
　　1.經(jīng)ox-LDL（100ug/ml）處理HUVECs6小時(shí)和12小時(shí)，后用透射電子

4、顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。透射電鏡顯示，對(duì)照組細(xì)胞核膜完整，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，胞漿內(nèi)各細(xì)胞器、細(xì)胞核形態(tài)和分布基本正常，未見明顯自噬空泡，溶酶體數(shù)目未見明顯增多。Ox-LDL(100ug/ml)作用于HUVECs6h、12h后，細(xì)胞質(zhì)中可見包含部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)成分、雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，表明ox-LDL可誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生自噬。自噬體可能源自無(wú)核糖體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分離的膜,這些分離的膜伸長(zhǎng)，在兩端彎曲以形成C形結(jié)構(gòu)和雙膜液泡,當(dāng)自噬體與溶酶體融合

5、時(shí)，內(nèi)膜消失，自噬體變成單膜自噬泡。并且，6h處理組中的自噬體數(shù)量高于12h處理組。
　　2.LC3-Ⅱ的檢測(cè)作為自噬激活的標(biāo)志物，與對(duì)照組相比，處理組細(xì)胞顯示LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表達(dá)水平增加，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，我們發(fā)現(xiàn)處理組細(xì)胞中p62的mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明，p62與自噬效應(yīng)蛋白LC3存在相互作用，并通過自噬溶酶體途徑降解。
　　3.Ox-LDL處理組細(xì)

6、胞中的P-Akt/Akt、P-mTOR/mTOR、P-p70S6K/p70S6K的蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要表現(xiàn)為ox-LDL抑制了Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)傳導(dǎo)通路中磷酸化蛋白P-Akt、P-mTOR、P-p70S6K的表達(dá)水平；然而，對(duì)信號(hào)傳導(dǎo)通路中總蛋白Akt、mTOR、p70S6K的表達(dá)水平影響不大。
　　研究結(jié)論：
　　在本研究中，我們提供證據(jù)表明ox-LDL（100ug/

7、ml）可以誘導(dǎo)HUVECs發(fā)生自噬。并且，我們的研究證明在ox-LDL處理HUVECs6小時(shí)和12小時(shí)后自噬體的數(shù)量顯著增加；與對(duì)照組相比，LC3-Ⅱ的mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，而ox-LDL處理組中p62的水平下調(diào)；這種效應(yīng)與12小時(shí)處理組相比，6小時(shí)處理組中的作用更為顯著。并且，Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)傳導(dǎo)通路中P-Akt、P-mTOR、P-p70S6K的表達(dá)水平降低?；诖?，我們認(rèn)為ox-LDL（100ug/ml）通過