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文檔簡介
1、目的:
探討mTOR/p70s6K信號通路在人腎小球系膜細胞中的表達;闡明活性維生素D3在腎小球系膜細胞中對mTOR/p70s6K信號通路的調(diào)控作用,為臨床上使用活性維生素D3治療慢性腎臟病提供堅實的理論基礎。
方法:
體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞,取傳代培養(yǎng)至3-7代細胞分為4組:正常對照組(加含5%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基),VD3組(加10-8mol/L1,25(OH)2D3),雷帕霉素組(加5μg/mL雷
2、帕霉素),VD3+雷帕霉素組(加10-8mol/L1,25(OH)2D3及5μg/mL雷帕霉素),干預48小時。倒置相差顯微鏡下觀察人腎小球系膜細胞形態(tài)變化及生長狀況,免疫熒光法檢測各組系膜細胞中mTOR、p70s6K蛋白的表達,實時熒光定量PCR法(RQ-PCR)檢測各組系膜細胞中mTOR mRNA、p70s6K mRNA的表達。
結果:
(1)各組系膜細胞生長及形態(tài)變化:正常對照組系膜細胞胞體呈長梭形、不規(guī)則星形
3、或樹枝狀,胞核居中,圓形或卵圓形,較清晰;VD3及雷帕霉素組,與正常對照組比較,細胞數(shù)目有所減少,細胞之間的鏈接減少,少數(shù)細胞胞膜皺縮,細胞體積較對照組變小,細胞核濃縮,部分胞漿濃縮甚至出現(xiàn)空泡,部分細胞漂??;VD3+雷帕霉素組,與VD3及雷帕霉素組相比,細胞核數(shù)目明顯減少,胞體長梭形突出或消失。
(2)免疫熒光檢測各組干預48h后人腎小球系膜細胞中mTOR、p70s6K蛋白的表達,與正常對照組比較,VD3組、雷帕霉素組、VD
4、3+雷帕霉素組系膜細胞中mTOR、p70s6K蛋白表達強度均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與VD3組比較,雷帕霉素組系膜細胞中mTOR、p70s6K蛋白表達強度無明顯降低,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與VD3、雷帕霉素組比較,VD3+雷帕霉素組系膜細胞中mTOR、p70s6K蛋白表達強度均降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
(3)RQ-PCR檢測各組干預48h后腎小球系膜細胞中mTOR mRNA、p70s
5、6K mRNA的表達:與正常對照組相比,VD3組、雷帕霉素組、VD3+雷帕霉素組系膜細胞中mTOR mRNA的表達顯著降低,p70s6K mRNA表達顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與VD3組比較,雷帕霉素組系膜細胞中mTOR mRNA、p70s6K mRNA表達無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與VD3、雷帕霉素組相比,VD3+雷帕霉素組系膜細胞中 mTOR mRNA的表達顯著降低,p70s6K mRNA表達顯
6、著增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結論:
(1)1,25(OH)2D3可顯著抑制人腎小球系膜細胞的增殖;
(2)mTOR/p70s6K信號通路存在于在人系膜細胞中,1,25(OH)2D3能通過阻滯該通路抑制系膜細胞增殖;
(3)1,25(OH)2D3可協(xié)同雷帕霉素抑制mTOR/p70s6K信號通路,加強抑制系膜細胞增殖;
(4)1,25(OH)2D3很可能是通過調(diào)控系膜細胞中相
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