Fezf2核定位信號(hào)研究.pdf

1、目的:Fezf2(Fez家族鋅指蛋白2),選擇性地表達(dá)于大腦皮質(zhì)第Ⅴ和Ⅵ皮層的下行性投射神經(jīng)元以及其前體細(xì)胞中。近來研究證實(shí),對(duì)于皮質(zhì)下軸突投射的形成和定向發(fā)育方面都起著非常重要的作用。本研究將首先探明Fezf2蛋白在小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育中的亞細(xì)胞定位,之后利用分子生物學(xué)方法,找到Fezf2蛋白的核定位信號(hào)序列,以便將來研究Fezf2入核行為對(duì)深皮質(zhì)神經(jīng)元形成的調(diào)控作用。
　　 方法:1.通過胚胎內(nèi)基因電穿孔技術(shù)將Fezf2-

2、GFP融合蛋白的表達(dá)載體在E13.5(深皮層神經(jīng)元產(chǎn)生時(shí)期)時(shí)導(dǎo)入小鼠胚胎側(cè)腦室,模仿其在體表達(dá),同時(shí)聯(lián)合E10.5的皮層原代培養(yǎng)細(xì)胞的免疫熒光共定位,以及在體外N2a細(xì)胞和293T細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)染,觀察Fezf2的亞細(xì)胞定位；
　　 2.從新生B6小鼠腦組織的cDNA文庫中采用PCR的方法擴(kuò)增Fezf2全長(zhǎng)及實(shí)驗(yàn)所需各缺失片段,并進(jìn)行克隆,形成GFP-Fezf2融合蛋白,表達(dá)于N2a細(xì)胞和293T細(xì)胞中,通過觀察GFP綠色熒光所

3、在的亞細(xì)胞定位,篩選出Fezf2的潛在核定位信號(hào)序列；
　　 3.擴(kuò)增篩選出來的潛在核定位信號(hào)序列,以相同手法研究其對(duì)該蛋白入核的充分性；
　　 4.應(yīng)用QuikChange()Ⅱ XL Site-Directed Mutagenesis Kit,對(duì)Fezf2全序范圍內(nèi)的堿性氨基酸組合進(jìn)行突變,找出核定位信號(hào)中關(guān)鍵的氨基酸。
　　 結(jié)果:1.在胚胎10.5小鼠的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)的細(xì)胞上,以及在體外培養(yǎng)的神經(jīng)

4、類細(xì)胞(N2a)和非神經(jīng)類細(xì)胞(293T)中轉(zhuǎn)染結(jié)果發(fā)現(xiàn),Fezf2限制分布在細(xì)胞核內(nèi)；
　　 2.在小鼠E13-5進(jìn)行胚胎基因轉(zhuǎn)染,將GFP-Fezf2導(dǎo)入深皮質(zhì)神經(jīng)元前體細(xì)胞中,在E15.5熒光觀察顯示,Fezf2表達(dá)于深皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)；
　　 3.通過一系列克隆及轉(zhuǎn)染結(jié)果,篩選得到了Fezf2潛在的非典型的核定位信號(hào)序列,堿基序列為953-1124；
　　 4.單獨(dú)擴(kuò)增上述Fezf2潛在的核定位信號(hào)序列

5、,進(jìn)行轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn),其對(duì)于入核行為關(guān)鍵但不充分。擴(kuò)大擴(kuò)增片段范圍,找到了對(duì)入核行為起充分作用的片段,堿基序列為704-1132；
　　 5.通過分子克隆形成GFP-Fezf2和GFP-Fezf2-GFP融合蛋白,增大Fezf2蛋白的分子質(zhì)量,使其超過自由擴(kuò)散入核的質(zhì)量上限,在N2a細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn),均定位于核內(nèi),說明Fezf2蛋白是通過其核定位信號(hào)經(jīng)主動(dòng)運(yùn)輸入核；
　　 6.對(duì)Fezf2全序范圍的相鄰及相隔堿性氨基酸組合

6、進(jìn)行突變,發(fā)現(xiàn)將位于318位的堿性氨基酸組氨酸(H)突變成中性氨基酸(L)后,該蛋白無法限制性分布在核內(nèi)。
　　 結(jié)論:1.Fezf2在小鼠中自E10.5的側(cè)腦室前體細(xì)胞中開始至新生早期,一直定位于細(xì)胞核中；
　　 2.Fezf2含有主動(dòng)入核的多肽,可以將大分子(倆個(gè)GFP)帶入核內(nèi)；
　　 3.在Fezf2基因中,位于704-1132的堿基序列,對(duì)應(yīng)第219-362位的氨基酸序列對(duì)于入核行為起到關(guān)鍵作用；