原型泡沫病毒PFV反式激活因子Bel1核定位機(jī)制相關(guān)研究.pdf

1、泡沫病毒（foamy virus，F(xiàn)V）基因組均編碼非結(jié)構(gòu)蛋白Tas(transactivator ofspumavirus，Tas)。Tas蛋白是泡沫病毒的反式激活因子，在病毒基因表達(dá)調(diào)控中至關(guān)重要，為病毒復(fù)制所必需，此蛋白在原型泡沫病毒(prototype foamy virus，PFV)中又名Bel1（between env and LTR，Bel1）。前人研究表明，PFV Bel1含有核定位信號(nuclear localiza

2、tion signal，NLS)，但對其NLS的具體序列、類型，不同研究組的結(jié)果存在明顯差異。He和Venkatesh等認(rèn)為Bel1核定位必需的最短氨基酸序列為209-226/211-225 aa;然而，Chang和Lee等研究認(rèn)為其核定位信號為雙分型，由兩部分堿性氨基酸序列199-200 aa和211-223aa組成。
　　本文首先對不同研究組之間的分歧結(jié)果進(jìn)行分析。通過定點(diǎn)突變并利用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察Bel1亞細(xì)胞分布，發(fā)現(xiàn)

3、殘基R221R222R223突變后會使Bel1改變亞細(xì)胞定位，由核定位轉(zhuǎn)為胞漿定位;而R199H200則不然，突變后的Bel1仍定位于細(xì)胞核。表明殘基R221R222R223對于Bel1核定位的作用十分關(guān)鍵，而殘基R199H200并不涉及Bel1的核定位。這說明Bel1的核定位信號并非由兩部分堿性氨基酸殘基組成，即并非雙分型。此外，盡管R199H200突變并不影響B(tài)el1的核定位，但是這一突變卻使Bel1喪失了反式激活PFV啟動子的活性

4、。隨后的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，殘基R199H200對于Bel1直接結(jié)合病毒啟動子DNA十分重要。在病毒感染性克隆中定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Bel1中R199H200突變相比R221R222R223突變對PFV復(fù)制的影響更為顯著。
　　為明確PFV Bel1核定位信號的具體序列及類型，我們進(jìn)行進(jìn)一步研究。首先利用EGFP-GST融合表達(dá)體系，插入Bel1截短片段，通過免疫熒光觀察其亞細(xì)胞分布，精確確定Bel1的核定位信號序列為215p

5、RQKRPR221;之后的定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)表明殘基K218、R219和R221為Bel1核定位所必需;結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果，確證Bel1核定位信號屬于單分型。
　　明確Bel1核定位信號的具體序列后，本文利用體內(nèi)GST-Pulldown、體外入核等手段探究了介導(dǎo)Bel1進(jìn)入細(xì)胞核的核輸入蛋白組分。通過體內(nèi)GST-Pulldown實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)野生型Bel1不能與β核輸入蛋白KPNB1相互作用，暗示Bel1可能采用經(jīng)典的入核途徑進(jìn)入細(xì)胞核

6、;發(fā)現(xiàn)α核輸入蛋白KPNA1、KPNA2、KPNA6和KPNA7均能與野生型Bel1相結(jié)合，而只有KPNA1、KPNA6和KPNA7能夠與截短體215-223發(fā)生相互作用，這表明KPNA1、KPNA6和KPNA7很可能是介導(dǎo)Bel1進(jìn)入細(xì)胞核的適配體分子。進(jìn)一步體外入核實(shí)驗(yàn)顯示，分別加入KPNA1、KPNA6或KPNA7并輔以其他必需的入核因子均使Bel1定位于細(xì)胞核，最終確定介導(dǎo)Bel1入核的適配體分子為KPNA1、KPNA6和KPN

7、A7。
　　綜上所述，本文精確定位Bel1的核定位信號序列為215pRQKRPR221，明確其類型為單分型;同時確定KPNA1、KPNA6和KPNA7是介導(dǎo)Bel1入核的適配體分子。此外，本文確定了殘基R199H200在Bel1反式激活PFV啟動子中的關(guān)鍵作用，并解析其分子機(jī)制，即涉及Bel1直接結(jié)合LTR和IP啟動子DNA。這些結(jié)果為正確劃分Bel1蛋白結(jié)構(gòu)域提供了新的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步探明泡沫病毒調(diào)控蛋白的入核機(jī)制提供詳實(shí)的實(shí)