2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、泡沫病毒(foamy virus,F(xiàn)V)基因組均編碼非結(jié)構(gòu)蛋白Tas(transactivator ofspumavirus,Tas)。Tas蛋白是泡沫病毒的反式激活因子,在病毒基因表達調(diào)控中至關(guān)重要,為病毒復制所必需,此蛋白在原型泡沫病毒(prototype foamy virus,PFV)中又名Bel1(between env and LTR,Bel1)。前人研究表明,PFV Bel1含有核定位信號(nuclear localiza

2、tion signal,NLS),但對其NLS的具體序列、類型,不同研究組的結(jié)果存在明顯差異。He和Venkatesh等認為Bel1核定位必需的最短氨基酸序列為209-226/211-225 aa;然而,Chang和Lee等研究認為其核定位信號為雙分型,由兩部分堿性氨基酸序列199-200 aa和211-223aa組成。
  本文首先對不同研究組之間的分歧結(jié)果進行分析。通過定點突變并利用間接免疫熒光實驗觀察Bel1亞細胞分布,發(fā)現(xiàn)

3、殘基R221R222R223突變后會使Bel1改變亞細胞定位,由核定位轉(zhuǎn)為胞漿定位;而R199H200則不然,突變后的Bel1仍定位于細胞核。表明殘基R221R222R223對于Bel1核定位的作用十分關(guān)鍵,而殘基R199H200并不涉及Bel1的核定位。這說明Bel1的核定位信號并非由兩部分堿性氨基酸殘基組成,即并非雙分型。此外,盡管R199H200突變并不影響B(tài)el1的核定位,但是這一突變卻使Bel1喪失了反式激活PFV啟動子的活性

4、。隨后的凝膠阻滯實驗結(jié)果表明,殘基R199H200對于Bel1直接結(jié)合病毒啟動子DNA十分重要。在病毒感染性克隆中定點突變實驗結(jié)果表明,Bel1中R199H200突變相比R221R222R223突變對PFV復制的影響更為顯著。
  為明確PFV Bel1核定位信號的具體序列及類型,我們進行進一步研究。首先利用EGFP-GST融合表達體系,插入Bel1截短片段,通過免疫熒光觀察其亞細胞分布,精確確定Bel1的核定位信號序列為215p

5、RQKRPR221;之后的定點突變實驗表明殘基K218、R219和R221為Bel1核定位所必需;結(jié)合生物信息學分析結(jié)果,確證Bel1核定位信號屬于單分型。
  明確Bel1核定位信號的具體序列后,本文利用體內(nèi)GST-Pulldown、體外入核等手段探究了介導Bel1進入細胞核的核輸入蛋白組分。通過體內(nèi)GST-Pulldown實驗,發(fā)現(xiàn)野生型Bel1不能與β核輸入蛋白KPNB1相互作用,暗示Bel1可能采用經(jīng)典的入核途徑進入細胞核

6、;發(fā)現(xiàn)α核輸入蛋白KPNA1、KPNA2、KPNA6和KPNA7均能與野生型Bel1相結(jié)合,而只有KPNA1、KPNA6和KPNA7能夠與截短體215-223發(fā)生相互作用,這表明KPNA1、KPNA6和KPNA7很可能是介導Bel1進入細胞核的適配體分子。進一步體外入核實驗顯示,分別加入KPNA1、KPNA6或KPNA7并輔以其他必需的入核因子均使Bel1定位于細胞核,最終確定介導Bel1入核的適配體分子為KPNA1、KPNA6和KPN

7、A7。
  綜上所述,本文精確定位Bel1的核定位信號序列為215pRQKRPR221,明確其類型為單分型;同時確定KPNA1、KPNA6和KPNA7是介導Bel1入核的適配體分子。此外,本文確定了殘基R199H200在Bel1反式激活PFV啟動子中的關(guān)鍵作用,并解析其分子機制,即涉及Bel1直接結(jié)合LTR和IP啟動子DNA。這些結(jié)果為正確劃分Bel1蛋白結(jié)構(gòu)域提供了新的實驗數(shù)據(jù),為進一步探明泡沫病毒調(diào)控蛋白的入核機制提供詳實的實

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