豬圓環(huán)病毒衣殼蛋白核定位信號對其復(fù)制的影響及突變體病毒的免疫原性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科,圓環(huán)病毒屬,無囊膜,直徑約17nm,是最小的動物病毒之一,其因組為一單鏈環(huán)狀DNA。PCV分為兩個基因型,PCV1無致病性,廣泛存在于豬群中。而PCV2被認(rèn)為是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要致病因子,可引起消瘦、可視黏膜蒼白、呼吸困難、間歇性腹瀉及淋巴結(jié)腫脹等癥狀,對養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。PCV1和PCV2均包含ORF1、ORF2和ORF3三個主要的開

2、放閱讀框。其中ORF2編碼病毒的衣殼蛋白,并且是PCV2的主要毒力因子和免疫原性蛋白。研究表明,植物單鏈環(huán)狀病毒核衣殼蛋白核定位信號(NLS)的破壞或缺失直接導(dǎo)致ssDNA積聚減少,從而影響病毒的復(fù)制增殖。核衣殼蛋白有可能通過與復(fù)制相關(guān)蛋白的作用而參與調(diào)節(jié)病毒基因組的復(fù)制。對PCV2核衣殼蛋白的研究將有助于深入了解病毒復(fù)制、致病性,開發(fā)有效的病毒疫苗。而豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的病原之一,嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)

3、展,目前還沒有有效疫苗。本項目以PCV2 ORF2為基礎(chǔ),在對浙江省及周邊地區(qū)豬場PCV2感染血清學(xué)和分子流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上,比較深入地開展了PCV核衣殼蛋白核定位信號對PCV2復(fù)制的影響和重組病毒的免疫原性研究。由于該病毒在體外培養(yǎng)細(xì)胞中的增殖較慢,是影響疫苗研發(fā)的瓶頸問題,本研究針對PCV2復(fù)制問題開展的研究,具有重要的理論和實(shí)際意義。
　　 首先,分別應(yīng)用PCR和ELISA方法對2003-2007年浙江省及其周邊上海、江

4、蘇等地豬場采集的169份病豬組織和1779份血清進(jìn)行了PCV2及其特異性抗體的檢測。結(jié)果顯示,淋巴結(jié)中PCV2的PCR陽性率為52.07％(88/169),豬群PCV2抗體陽性率為46.0％(819/1779)。其中斷奶后仔豬(54.1％,223/412)和肥育豬血清(49.9％,423/848)PCV2抗體陽性率顯著高于哺乳仔豬的陽性率(33.3％,173/519)。進(jìn)一步擴(kuò)增27株2004-2007年不同地區(qū)PCV2毒株的ORF2基

5、因,進(jìn)行測序并分析其分子流行特點(diǎn)。結(jié)果顯示該地區(qū)PCV2毒株彼此間核苷酸的同源性較高(98％-100％),但與國內(nèi)其它地區(qū)或國外毒株相比具有明顯的氨基酸變異,特別是衣殼蛋白的兩個主要抗原表位區(qū)內(nèi)氨基酸位點(diǎn)變異率非常高,導(dǎo)致其親水性發(fā)生明顯改變。遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的所有PCV2毒株與部分國內(nèi)毒株處于同一分支內(nèi),而與大部分國內(nèi)或國外的PCV2毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。以上結(jié)果說明PCV2感染在浙江省及周邊省市呈廣泛流行并呈上升趨勢,而且其毒株具

6、有獨(dú)特的分子特征。
　　 PCV衣殼蛋白在胞漿內(nèi)合成后通過其自身核定位信號的作用轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)參與病毒的復(fù)制和組裝。預(yù)測結(jié)果表明PCV1 ORF2蛋白的N端也含有多個可能的單一型或雙分型核定位信號序列(NLS)。本研究將PCV1 ORF2及其突變體與eGFP融合,插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3,使其能融合表達(dá)兩個不同基因。轉(zhuǎn)染細(xì)胞后觀察熒光,以分析和確證PCV1 ORF2蛋白中的核定位元件。試驗(yàn)結(jié)果表明,PCV1 ORF2蛋白C端

7、190個氨基酸缺失后不影響融合蛋白的核定位,即蛋白均集中于細(xì)胞核內(nèi),與野生型ORF2-EGFP融合蛋白一致。而其N端43位氨基酸序列的缺失導(dǎo)致融合蛋白喪失了核定位功能而使蛋白散布于PK-15細(xì)胞的胞漿內(nèi)。這說明PCV1 ORF2蛋白的核定位功能由其N端序列決定。進(jìn)一步對N端NLS序列中的堿性氨基酸殘基分別進(jìn)行點(diǎn)突變,結(jié)果表明氨基酸短肽9RRRR12的突變和25RRPYLAHPAFRNRYRWRRK43中后6個堿性氨基酸的突變導(dǎo)致融合表達(dá)

8、產(chǎn)物分布于整個細(xì)胞,喪失了完整的核定位功能,說明這兩個序列為PCV1 ORF2蛋白的核定位元件,與PCV2 ORF2蛋白的NLS有較大差異。
　　 應(yīng)用反向遺傳學(xué)技術(shù)可以詳細(xì)研究病毒的基因結(jié)構(gòu)和編碼蛋白的功能。我們將PCV2基因組克隆入pUC-18載體,并在其3’端亞克隆入一段重復(fù)序列,構(gòu)建了mPCV2感染性克隆。其中的重復(fù)序列有助于DNA在細(xì)胞內(nèi)通過同源重組自身環(huán)化并從質(zhì)粒中釋放。以同樣策略構(gòu)建了PCV1基因組為骨架、含有PC

9、V2ORF2的雜合型PCV12感染性克隆以及PCV2 ORF2核定位信號序列(NLS)被PCV1 ORF2相應(yīng)序列替換的PCV2-2NLS1和PCV12-2NSL1兩種雜合型感染性克隆,以研究PCV核定位信號元件對于病毒復(fù)制的影響。結(jié)果表明4個感染性克隆轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后均能產(chǎn)生感染性的病毒粒子。連續(xù)傳代穩(wěn)定后,mPCV2和PCV12病毒分別能達(dá)到105.5和105 TCID50/ml,滴度與野毒株P(guān)CV2相似。而雜合病毒PCV2-2

10、NLS1和PCV12-2NLS1的滴度則顯著低于野毒PCV2(103.5TCID50/ml)。mPCV2和PCV12要比PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1在PK-15細(xì)胞具更強(qiáng)的復(fù)制能力:mPCV2和PCV12從感染后12h的102TCID50/ml達(dá)到96h時的104TCID50/ml左右,但PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1只達(dá)到103TCID50/ml左右。
　　 將各重組病毒以相同劑量接種8周齡的BA

11、LB/c小鼠,比較它們在體內(nèi)的復(fù)制能力、致病性和免疫原性差異。雖然mPCV2組小鼠血清中病毒含量顯著高于PCV12接種組,但它們誘導(dǎo)的血清抗體效價沒有顯著差異,表明它們在體內(nèi)具有相似的免疫原性。而PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1組小鼠只有少數(shù)能從血清中檢測到低水平的病毒量和PCV特異性抗體。致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各病毒接種組均未出現(xiàn)明顯的肺部病變。野毒株P(guān)CV2(SH04)和mPCV2組小鼠脾臟均出現(xiàn)了輕度的顯微病變,與對照組相比差

12、異顯著。但三個雜合型病毒PCV12、PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1接種組小鼠脾臟的病變程度與對照組差異不顯著。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示SH04和mPCV2接種后,小鼠外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞含量顯著低于其余各組(p＜0.05)。但PCV12接種組小鼠外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化與對照組相比不明顯。因此,PCV12在體內(nèi)的致病性明顯低于野毒株SH04和重組PCV2病毒,但與PCV2野毒株具有相似的免疫原性。然而,PCV2-

13、2NLS1和PCV12-2NLS1在體內(nèi)外都只表現(xiàn)較弱的復(fù)制增殖能力,表明將PCV1核衣殼蛋白NLS序列替換PCV2相應(yīng)部位序列并沒有提高PCV2病毒的復(fù)制能力。相反地,由于包含PCV1和PCV2 ORF2蛋白核定位信號的N端核衣殼序列的互換可能使雜合型核衣殼蛋白核定位功能減弱或喪失,甚至導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)和功能的改變,從而影響病毒的復(fù)制和組裝。
　　 綜上所述,本論文對浙江省及其周邊地區(qū)豬場中PCV2的流行進(jìn)行了系統(tǒng)的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)PC

14、V2感染呈廣泛流行并有明顯上升趨勢,且其毒株與國內(nèi)外其它毒株相比在ORF2蛋白的兩個主要抗原表位區(qū)具有較大差異。同時,我們發(fā)現(xiàn)PCV1ORF2蛋白的核定位功能由其N端氨基酸短肽9RRRR12和25RRPYLAHPAFRNRYRWRRK43決定,與PCV2 ORF2蛋白的NLS有較大差異。重組病毒體內(nèi)外特性研究表明PCV12對小鼠的致病性明顯低于野毒株P(guān)CV2和mPCV2病毒,但它們卻具有相似的復(fù)制能力和免疫原性。而PCV2-2NLS1和

15、PCV12-2NLS1病毒在體內(nèi)外復(fù)制能力都較弱,表明將PCV1核衣殼蛋白NLS序列替換PCV2相應(yīng)部位序列并沒有明顯提高PCV2病毒的復(fù)制能力。提示PCV2-2NLS1和PCV12-2NLS1病毒核衣殼蛋白的核定位元件中可能存在關(guān)鍵堿性氨基酸位點(diǎn)對于病毒復(fù)制具有重要影響或致死性的,從而影響了病毒的復(fù)制和組裝。進(jìn)一步研究可對PCV1和PCV2核衣殼蛋白不同的核定位元件中的堿性氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變,從而在更大程度上保證Cap蛋白的完整性和兼