p33ING1b核定位信號肽入核引導(dǎo)作用及其融合蛋白表達(dá)純化的研究.pdf

1、[目的]:生長抑制因子基因1(Inhibitorofgrowthgene1，ING1)定位于人類染色體13q33-34，是1996年發(fā)現(xiàn)的一個生長抑制基因。其主要生理功能為調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，參與細(xì)胞衰老和凋亡調(diào)控，并在維持基因組穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。p33ING1b是其最主要的編碼蛋白。以往的研究證實多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞中NG1基因突變率很低；其mRNA轉(zhuǎn)錄豐度及p33ING1b蛋白表達(dá)水平目前各家研究結(jié)果不一，尚無定論，但較一致

2、的發(fā)現(xiàn)是膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有p33ING1b蛋白的亞細(xì)胞定位異常，即從正常情況下定位于胞核變?yōu)槎ㄎ挥诎麧{，這可能是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的重要因素。一般情況下細(xì)胞漿向細(xì)胞核內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)運通過Importinα/β蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)實現(xiàn)，Importinα作為適配器既與被運載蛋白的核定位信號肽(Nuclearlocalizationsignal；NLS)結(jié)合，又與Importinβ結(jié)合，形成三聯(lián)轉(zhuǎn)運復(fù)合物，并通過importinβ與核孔復(fù)合體(Nucle

3、ar-porecomplex；NPC)作用，啟動一系列入核轉(zhuǎn)運機制。然而，生理情況下p33ING1b蛋白的入核轉(zhuǎn)運機制怎樣?是什么原因?qū)е铝四z質(zhì)瘤細(xì)胞中p33ING1b蛋白的亞細(xì)胞定位異常?均尚不清楚，有必要作深入系統(tǒng)的探討。 為此，本研究以p33ING1b蛋白核定位信號肽(p33ING1bNLS)的功能研究入手，采用一系列分子生物學(xué)實驗方法，初步探討了生理情況下p33ING1bNLS在p33ING1b入核轉(zhuǎn)運過程中的作用。旨在

4、為進(jìn)一步深入探討p33ING1b蛋白正常入核機制及其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中入核失敗的原因提供重要的線索及有用的研究工具。 [方法]:在本研究第一部分，我們首先應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(ReversetranscriptPCR；RT-PCR)方法，從人胚肺纖維母細(xì)胞系MRC-5中擴增了p33ING1bNLS的互補DNA(ComplementaryDNA；cDNA)片斷，應(yīng)用基因重組技術(shù)將這段c-DNA插入克隆載體Pbluescript-SK，經(jīng)D

5、NA測序證實堿基序列無誤后，將該片段插入綠熒光蛋白(GFP)真核表達(dá)載體pEGFP-C1的多克隆位點，構(gòu)建了GFP和p33ING1bNLS融合蛋白(GFP-NLS)的重組真核表達(dá)載體pEGFP-C1-NLS。然后用pEGFP-C1-NLS轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞，在其中表達(dá)GFP-NLS。通過綠熒光蛋白的示蹤作用，在熒光顯微鏡下觀察GFP-NLS的亞細(xì)胞定位，以便證實生理情況下p33ING1bNLS是否在該蛋白入核轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。

6、 在本研究第二部分，首先以第一部分Pbluescript-SK中插入的p33ING1bNLScDNA片段為模板，通過PCR擴增適合插入原核表達(dá)載體pGEX-5X-3的p33ING1bNLScDNA片段，并將該片段插入pGEX-5X-3的多克隆位點，構(gòu)建了p33ING1bNLS和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathion-S-transferase；GST)融合蛋白(GST-NLS)的原核表達(dá)載體pGEX-5X-3-NLS。然后將該載

7、體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，通過IPTG誘導(dǎo)其在BL21中大量表達(dá)GST-NLS。應(yīng)用超聲裂解菌體，將菌體裂解液與谷胱甘肽瓊脂糖球珠混合，通過GST與谷胱甘肽的特異性結(jié)合使融合蛋白吸附沉淀，洗凈雜蛋白后應(yīng)用洗脫液將純化的GST-NLS洗脫下來。 [結(jié)果]:第一部分：經(jīng)酶切和DNA測序鑒定證實，我們已經(jīng)通過RT-PCR成功的從MRC-5細(xì)胞系中擴增得到了p33ING1bNLS的cDNA片段，并將其插入了克隆載體Pbluescrip

8、t-SK中進(jìn)行擴增，經(jīng)鑒定該擴增片段的堿基序列完全正確。在將該擴增片段插入到真核表達(dá)載體pEGFP-C1后，經(jīng)酶切和DNA測序證實，插入片段的全部堿基序列及其編碼框和終止子的堿基序列均完全正確。將該重組載體pEGFP-C1-NLS轉(zhuǎn)染到MRC-5細(xì)胞內(nèi)后，GFP-NLS獲得有效表達(dá)，其綠熒光信號完全定位于細(xì)胞核。而空載體pEGFP-C1在MRC-5細(xì)胞中表達(dá)的綠熒光蛋白的熒光信號完全定位于細(xì)胞漿。 第二部分：經(jīng)酶切和DNA測序鑒

9、定證實，我們已經(jīng)通過PCR成功的從Pbluescript-SK中擴增得到了p33ING1bNLS的cDNA片段，并將其插入到pGEX-5X-3的多克隆位點，經(jīng)鑒定證實所插入cDNA片段的全部堿基序列及其編碼框和和終止子的堿基序列均完全正確，插入片段全長183bp。編碼框分析pGEX-5X-3空載體表達(dá)的GST全長243個氨基酸，分子量約26.73kDa，pGEX-5X-3-NLS表達(dá)的GST-NLS全長287個氨基酸，分子量31.57k

10、Da。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌B21中成功的大量表達(dá)了GST-NLS和GST蛋白。經(jīng)過谷胱甘肽瓊脂糖珠子親和沉淀純化，GST-NLS和GST蛋白被成功的純化出來。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳證實，被純化的GST-NLS和GST中無明顯雜蛋白條帶。 [結(jié)論]:以上結(jié)果說明在生理狀態(tài)下，p33ING1b完全定位于活細(xì)胞的核內(nèi)，而且它的NLS在其入核轉(zhuǎn)運過程中起著決定性作用。此外，在該項研究中成功構(gòu)