口服減毒沙門氏菌傳遞shRNA表達載體在抗腫瘤治療中的應用及前腦特異轉錄因子Fezf2對斑馬魚多種神經(jīng)元協(xié)調發(fā)育的調控.pdf

1、第一部分口服減毒沙門氏菌傳遞shRNA表達載體在抗腫瘤治療中的應用
　　RNA干擾是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉座子活動、調控基因表達的機制，雙鏈RNA(dsRNA).經(jīng)剪切后通過堿基互補配對被定位到同源mRNA轉錄本，導致靶標基因表達被抑制，即所謂的轉錄后基因沉默。從RNA干擾機制被闡明至今，RNA干擾技術已成為一種普遍采用的基因組研究的實驗工具，并被認為是一種極有潛力的疾病治療手段。然而，盡管siRNA具備做為小分

2、子藥物的潛力，將siRNA引入臨床卻受到了siRNA的穩(wěn)定性和傳遞時的靶向性問題的困擾。而表達shRNA的載體雖然能夠在體外培養(yǎng)的細胞和動物體內介導長時間的RNA干擾，但表達載體的有效傳遞依然存在問題。
　　隨著腫瘤治療學和細菌學研究的發(fā)展，減毒沙門氏菌載體系統(tǒng)作為治療惡性腫瘤的呈遞工具逐漸為人們所認識。通過口服或靜脈注射，沙門氏菌能夠有效地聚集到多種腫瘤中并抑制腫瘤生長，甚至可以追蹤轉移的腫瘤；此外，沙門氏菌還能將攜帶的外源DN

3、A傳遞到腫瘤細胞中，發(fā)揮載體作用。考慮到沙門氏菌特有的靶向腫瘤和傳遞外源功能性DNA的能力，我們首次嘗試了使用減毒沙門氏菌做為傳遞shRNA表達質粒的載體，在腫瘤細胞中介導基于DNA載體的RNA干擾策略。研究選取了在90％以上惡性黑色素瘤中表達，并通過抑制細胞凋亡導致腫瘤細胞高轉移能力的基因bcl2為靶標基因，以減毒沙門氏菌為運輸載體，經(jīng)口服將攜帶表達特異shRNA的質粒載體導入荷瘤小鼠體內。實驗結果顯示，減毒沙門氏菌能聚集在腫瘤中，并

4、將shRNA表達質粒傳遞到腫瘤細胞，引起荷瘤小鼠腫瘤細胞中bcl2基因的表達水平顯著降低，瘤體生長受到抑制(p<0.01)，小鼠壽命顯著延長(p<0.05)。使用減毒沙門氏菌運輸shRNA表達載體，在腫瘤細胞中誘發(fā)RNA干擾，特異性地沉默腫瘤發(fā)生過程中的關鍵基因，這一方法有效解決了shRNA表達質粒的腫瘤靶向性問題，同時利用減毒沙門氏菌的抗腫瘤效應，將兩種強有力的腫瘤治療手段結合起來，為提高癌癥治療方法的實用性和有效性進行了有益的探索。

5、
　　第二部分前腦特異轉錄因子Fezf2對斑馬魚多種神經(jīng)元協(xié)調發(fā)育的調控
　　脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)是生命體最為復雜的結構之一，神經(jīng)系統(tǒng)的結構和機能單位是神經(jīng)細胞(又稱為神經(jīng)元)。神經(jīng)元的形態(tài)結構千差萬別、數(shù)量定位也各不相同，并能合成分泌不同的神經(jīng)遞質、建立不同的連接模式。在發(fā)育過程中，不同的神經(jīng)元是由共同的前體細胞產(chǎn)生的，我們對于調控前體細胞分化成不同類型神經(jīng)元的機制所知極少。本課題選取了斑馬魚問腦神經(jīng)發(fā)育為研究對象，探究了

6、調控神經(jīng)分化的機制，發(fā)現(xiàn)在進化中保守的前腦特異鋅指結構轉錄因子Fezf2(又稱為Fezl)能夠調控問腦結節(jié)后和下丘腦區(qū)域(PT/H區(qū)域)多種神經(jīng)元協(xié)調產(chǎn)生。Fezf2功能喪失不僅影響PT/H區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元和催產(chǎn)素能神經(jīng)元的發(fā)育，也會導致該區(qū)域GABA神經(jīng)元和其它一些Islet1陽性中間神經(jīng)元的缺失；在早期神經(jīng)元發(fā)育受損的同時，少突神經(jīng)膠質細胞前體細胞標志之一Olig2的表達卻增加了。進一步的分析發(fā)現(xiàn)，受Fezf2

7、影響的PT/H區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元、5-羥色胺能神經(jīng)元和GABA神經(jīng)元在發(fā)育的相同階段產(chǎn)生。與不同神經(jīng)前體細胞分化和不同神經(jīng)元命運相關的proneural基因neurogenin1和ascl1a以及在多巴胺能神經(jīng)元中表達的otpb和在分化中的GABA神經(jīng)元中表達的dlx2都是Fezf2作用的下游因子，表明Fezf2通過在發(fā)育早期建立表達不同proneural基因的神經(jīng)前體細胞群體來協(xié)調不同類型神經(jīng)元的發(fā)育，同時也能調控在特異神經(jīng)元中表達的

8、決定因子，在發(fā)育的不同階段調控了神經(jīng)細胞的命運。Fezf2激活前體細胞中proneural基因的表達能夠活化相鄰細胞中的Notch信號通路，而活化了的Notch信號通路則抑制fezf2的表達。由此可見，前腦特異的轉錄因子Fezf2能夠調控多種神經(jīng)元的協(xié)調發(fā)育并受到Notch信號通路的負反饋調控。事實上，存在于特定區(qū)域前體細胞中的調控因子(如前腦中的Fezf2)與Notch信號通路間的相互調控可能是在器官發(fā)育過程中協(xié)調不同類型細胞有序產(chǎn)生