補腎方藥有效成分配伍對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞生物學活性的實驗性比較研究.pdf

1、目的：骨質(zhì)疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種全身性代謝性骨病，是目前世界上發(fā)病率、死亡率及保健費用消耗較大的疾病之一。據(jù)統(tǒng)計全世界目前約有2億人患有骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松癥發(fā)病?！办o悄悄”，“不知不覺”，一旦發(fā)現(xiàn)多已經(jīng)發(fā)展到一定程度，因此越來越引起人們的重視。從細胞學水平上來研究骨質(zhì)疏松的發(fā)病機理及其藥效評價已經(jīng)成為基礎(chǔ)與臨床研究的熱點。成骨細胞和破骨細胞之間的動態(tài)平衡在維持骨的正常結(jié)構(gòu)和代謝中具有重要作用。骨質(zhì)疏松是由于骨吸收

2、和骨形成解偶聯(lián)，骨吸收大于骨形成導致骨量丟失而引起。大量資料顯示：成骨細胞的增殖抑制、分化程度降低是造成骨質(zhì)疏松的重要原因。
　　 中醫(yī)藥學（TCM）認為骨與腎的關(guān)系密切，其在預防和治療骨質(zhì)疏松及骨折方面存在著悠久的歷史。祖國醫(yī)學古典醫(yī)籍《黃帝內(nèi)經(jīng)》中，有很多類似于骨質(zhì)疏松的名稱的記載，歷代也有不少治療骨質(zhì)疏松的名方。本實驗中補腎方藥由熟地黃、淫羊藿、山藥、丹參、骨碎補、獨活組成。有效部位的單體化合物依次是梓醇、淫羊藿苷、薯蕷皂

3、苷元、丹參酮ⅡA、柚皮苷、羥甲香豆素。
　　 細胞培養(yǎng)技術(shù)（Cell culture technique），是生命科學研究中一個必不可少的技術(shù)。我們多次酶消化-貼塊法對SD大鼠原代成骨細胞的體外培養(yǎng)，而獲得足夠數(shù)量的成骨細胞。首先觀察成骨細胞在生長過程中的形態(tài)學變化，進而以體外培養(yǎng)的SD大鼠成骨細胞5～6代為實驗對象，采用補腎方藥不同單體配伍、生藥配伍、淫羊藿苷單體進行成骨細胞干預性培養(yǎng)，在不同濃度、不同時間及不同配伍的情況下，

4、采用噻唑藍法（MTT）和對硝基苯二鈉基質(zhì)動力學法（pNPP）分別對大鼠成骨細胞的增殖與分化進行測定。通過比較和觀察補腎方藥不同配伍對成骨細胞的增殖和分化的影響，從而初步確定補腎方藥及其組分配伍有效性及其有效濃度范圍。
　　 方法：
　　 1、我們選用新生（<24h）SD大鼠顱蓋骨為試驗材料，采用多次酶消化-貼塊法對大鼠原代成骨細胞的體外培養(yǎng)。倒置顯微鏡下對原代成骨細胞形態(tài)學變化進行觀察；
　　 2、補腎方藥的配伍

5、分組：依據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論和方劑學配伍規(guī)律將補腎方藥中“地黃+淫羊藿+山藥”和“骨碎補+丹參+獨活”各分為一類，即：“補藥”（Tonics Medicine，TMed）和“瀉藥”（Cathartic Medicine，CMed）。
　　 “補藥”（TMed）和“瀉藥”（CMed）分為生藥（Crude Drug）（原藥直接提取的成分）和單體（monomer）（有效化學成分）兩種，稱為“補藥生藥配伍組（crude Tonics Herb

6、s Compatibility Groups，cTHCG）”和“瀉藥生藥配伍組（crude Cathartic Herbs Compatibility Groups，cCDCG）”，分別用“CT”組和“CC”組表示；“補藥單體配伍組（monomer Tonics Drug Compatibility Group，mTDCG）”和“瀉藥單體配伍組（monomer Cathartic Drug Compatibility Group，mCD

7、CG）”分別用“MT”和“MC”表示。補腎方藥的試驗分組：分8組，①CT>CC組，②CT=CC組，⑧CTMC組，⑥MT=MC組，⑦MT　　 3、補腎方藥配伍的用藥比例：
　　 “補藥”（TMed）>“瀉藥"（CMed）：地黃：淫羊藿：山藥：骨碎補：丹參：獨活（2：2：2：1：1：1）；<

8、br>　　 “補藥”（TMed）=“瀉藥”（CMed）：地黃：淫羊藿：山藥：骨碎補：丹參：獨活（1：1：1：1：1：1）；
　　 “補藥”（TMed）<“瀉藥”（CMed）：地黃：淫羊藿：山藥：骨碎補：丹參：獨活（1：1：1：2：2：2）；
　　 4、用噻唑藍比色法（MTT）法測成骨細胞的增殖；加入濃度各為10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml的補腎方藥及中藥單體；繼續(xù)培養(yǎng)24h、28h、72h后，加入MTT2

9、0μl，用酶標儀測定OD值，觀察對大鼠成骨細胞增殖的影響。
　　 5、用對硝基苯二鈉基質(zhì)動力學法（pNPP）測定大鼠成骨細胞的分化；換上補腎方藥及中藥單體，加藥濃度各為10ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml后；繼續(xù)培養(yǎng)24h、28h、72h后，吸棄培養(yǎng)液，加入0.25ml0.1％Triton溶液，按試劑盒說明測定，結(jié)果以每克蛋白中堿性磷酸酶（ALP）的國際單位（U/g protein）表示，該方法通過對ALP含量的測

10、定，進而可反映OB的分化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、多次酶消化-貼塊法大鼠原代成骨細胞的體外培養(yǎng)的形態(tài)學觀察
　　 1.1倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，原代成骨細胞由大鼠顱蓋骨周爬出，貼壁、展開，呈多邊形、三角形；剛接種的成骨細胞呈球形，24h內(nèi)存活細胞已沉降貼壁，完全展開，呈三角形、梭狀形，核明顯增大；傳代培養(yǎng)5天，細胞形態(tài)可見多樣化；培養(yǎng)8～15天，可見長索性、多角形、條索形，匯合時細胞呈鋪路石狀，可重疊生長；1

11、5天后，可出現(xiàn)膠原堆積和鈣鹽沉積。
　　 1.2堿性磷酸酶染色可觀察到成骨細胞酶活性部位呈現(xiàn)紫色細顆粒狀。
　　 2、MTT法測定補腎方藥對大鼠成骨細胞的增殖
　　 2.1與對照組相比，濃度為10ng/ml時，在24 h測定MT>MC組增高（P<0.05）；在48h測得CT>CC組，CT=CC組，MT>MC組，有明顯促增殖作用（P<0.05）；在72 h濃度下，MT>MC組具有顯著促增殖作用（P<0.05）；

12、r>　　 2.2與對照組相比，濃度為20ng/ml時，在24 h測定CT>CC組和MT>MC組有促增殖作用（P<0.05）；在48h測得CT>CC組、MT>MC組具有促增殖作用，以CT>CC組明顯（P<0.05）；在72 h，CT>CC和MT>MC組具有促增殖作用（P<0.05）；
　　 2.3與對照組相比，濃度為30ng/ml下，在24 h測定CT>CC組有明顯促增殖作用（P<0.05）；在48h測得CT>CC組，MT>MC

13、組，MTCC組促增殖作用強（P<0.05）；
　　 3、對硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)動力學法（PNPP）測定補腎方藥對大鼠成骨細胞的分化影響
　　 3.1與對照組相比，濃度為10 ng/ml時，在24 h是測定MT>MC組ALP增高P<0.05）；在48h測得MT>MC組有明顯促ALP作用（P<0.05）；在72h測得結(jié)果，MT>MC組，MT=MC組的ALP含量明顯升

14、高，（P<0.05）；
　　 3.2與對照組相比，濃度為20ng/ml時，在24 h測定CT>CC組、CT=CC組、MT>MC組和MT=MC組有促ALP作用（P<0.05）；在48h和72 h測定ALP的含量，CT>CC組有明顯的促ALP分泌作用（P<0.05）；
　　 3.3與對照組相比，濃度為30ng/ml下，在24h是測定CT>CC組、MT>MC組有促ALP分泌作用，CT>CC組較明顯（P<0.05）；在48h和7

15、2 h測得CT>CC組有促明顯的促ALP分泌作用（P<0.05）；
　　 結(jié)論：
　　 1、補藥單體配伍組>瀉藥單體配伍組（MT>MC）在10ng/ml濃度72h時測得的結(jié)果最高，推斷低濃度的單體配伍對大鼠成骨細胞的增殖和分化具有促進作用；
　　 2、補藥單體配伍組>瀉藥單體配伍組（MT>MC）可能具有量-效和時-效關(guān)系。推斷其量效關(guān)系為：隨著濃度（劑量）的增加對大鼠成骨細胞的增殖和分化作用反而減弱；同一濃度下，

16、24h與72h相比較推斷其時-效關(guān)系：72h時具有明顯的促進成骨細胞增殖和分化的作用；
　　 3、補藥生藥配伍組>瀉藥生藥配伍組（CT>CC）在30ng/ml時具有促進成骨細胞增殖和分化的作用，推斷其量-效和時-效關(guān)系為：隨著濃度（劑量）和時間的增加對大鼠成骨細胞的增殖和分化作用而增強；
　　 4、補藥>瀉藥（TMed>CMed）的配伍關(guān)系，對成骨細胞具有更好的干預效果；就本方劑來講起效部位可能是梓醇、淫羊藿苷、薯蕷皂苷