改良HBSS液對(duì)體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞生物學(xué)活性的影響.pdf

1、背景：
　　 牙齒外傷為兒童和青少年常見(jiàn)的口腔頜面部損傷之一，其發(fā)生率為15-21％，而牙脫位（美國(guó)兒科牙學(xué)會(huì)將其定義為“牙齒完全從牙槽窩中移位”）是牙齒外傷中最嚴(yán)重的一種，約占恒牙外傷的16％[3]。當(dāng)牙脫位時(shí)，除了牙周膜(periodontal ligament，PDL)完全撕裂外，還伴有局部牙骨質(zhì)、牙槽骨和附著組織的損傷以及牙髓壞死等。牙脫位若治療不當(dāng)則很容易造成牙齒缺失，影響到傷者的面容美觀和咀嚼功能，更有甚者還有可能影

2、響到青少年傷者的心理健康發(fā)育。
　　 治療牙脫位的最好方法是即刻再植，即刻再植不僅能迅速恢復(fù)PDL的營(yíng)養(yǎng)支持，而且能最大化地維持牙根面牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLC）的活性和增殖能力，提高功能性愈合（functional healing，F(xiàn)H）的幾率，進(jìn)而能最大限度的保存患牙，維護(hù)牙列的完整性和美觀性。雖然即刻再植治療脫位牙能得到最好的預(yù)后，但即刻再植通常很難實(shí)現(xiàn)。不過(guò)，對(duì)于不能即刻再

3、植的脫位牙則應(yīng)最大限度地保存殘留在牙根面上的PDLC活性，來(lái)提高脫位牙延時(shí)再植的成功率。據(jù)報(bào)道，牙根面存留的有活性的PDLC隨著體外干燥時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，脫位牙體外干燥2h后根面幾乎找不到活細(xì)胞[4]。Cvek等的調(diào)查研究顯示脫位后干燥放置15 min、20～40 min和60 min的牙齒再植后分別有13％、40％和100％的牙齒發(fā)生了置換性吸收[5]，而造成再植牙失敗的主要原因是牙根的炎癥性吸收(inflammatory resor

4、ption，IR)和置換性吸收(replacement resorption，RR)。Andreasen JO對(duì)影響再植牙形成FH的因素進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，對(duì)形成FH有影響的因素由強(qiáng)至弱依次為牙根發(fā)育階段、體外干燥放置時(shí)間、即刻再植和體外濕保存時(shí)間[6]。再有，許多研究結(jié)果顯示與縮短口外放置時(shí)間比較，用保存介質(zhì)保存PDLC活性來(lái)預(yù)防脫位牙再植后的RR和IR則更為關(guān)鍵[7]。
　　 理想的脫位牙保存介質(zhì)應(yīng)具有生理性滲透壓和pH值、能保

5、存PDLC的活性、粘附力和增殖能力、以及容易獲得且保質(zhì)期長(zhǎng)等特性。HBSS液(Hank's balancedsalt solution)是美國(guó)牙髓醫(yī)師學(xué)會(huì)推薦的最佳牙齒保存液，含有細(xì)胞生存所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，滲透壓290-320 mOsm/L，pH值7.2，適宜細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。但是因?yàn)樵谒幍昀餆o(wú)售而一直沒(méi)有被廣泛使用。牛奶因?yàn)楹?xì)菌量低，并且含有少量細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子而被廣泛接受，但是它的效果是否與HBSS液一樣還存在爭(zhēng)議，

6、有報(bào)道認(rèn)為它只能在3h內(nèi)保存細(xì)胞活性[9]。器官保存液ViaSpan(@)也被研究用做PDLC的保存介質(zhì)，它能有效保存唇成纖維細(xì)胞活性至168 h，且在ViaSpan(@)中保存6h和12h的狗牙再植后既未發(fā)生IR，也未發(fā)生RR[10,11]。雖然ViaSpan(@)能長(zhǎng)時(shí)間地保存細(xì)胞活性，但因價(jià)格昂貴而不適于普遍使用。Buttke TM認(rèn)為ViaSpan(@)含有的還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)能分解過(guò)氧化氫，保護(hù)P

7、DLC免受氧化損傷;他的研究也證實(shí)在添加了100 U/ml過(guò)氧化氫酶的HBSS液中保存過(guò)的狗脫位牙，再植后的根面吸收率顯著低于未添加過(guò)氧化氫酶的HBSS液組[3]。
　　 德國(guó)Dentosafe(@)公司生產(chǎn)了一種名為牙科急救箱的脫位牙齒保存液，被瑞士和澳洲引進(jìn)放在易發(fā)生牙外傷的高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)——中小學(xué)校，體外實(shí)驗(yàn)表明這種牙齒保存液能在室溫下保存PDLC活性和增殖能力至48 h[12]。有報(bào)道對(duì)使用了牙科急救箱的6顆脫位牙做了長(zhǎng)期隨訪

8、，保存時(shí)間為1～53 h，這些牙齒再植后全部形成了牙周膜愈合[13]。由此可見(jiàn)，選擇適當(dāng)?shù)谋４娼橘|(zhì)濕保存脫位牙，對(duì)于保存牙根面PDLC的活性，提高再植牙的FH是非常重要的。
　　 目前我國(guó)對(duì)脫位牙齒保存液的研究甚少，也沒(méi)有商業(yè)化的脫位牙齒保存液出售，本研究目的是以HBSS液為基礎(chǔ)，將配制的改良HBSS液與HBSS液比較，探討其保存人PDLC生物學(xué)活性的效果，進(jìn)而為研究商業(yè)化脫位牙齒保存液提供初步實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一章、

9、人PDLC的原代培養(yǎng)及細(xì)胞來(lái)源鑒定
　　 目的:體外分離培養(yǎng)人PDLC，對(duì)細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行鑒定。
　　 方法:
　　 1、分離培養(yǎng)人PDLC門診收集因正畸需要拔除的無(wú)齲壞及其它牙體、牙周組織疾病的上頜或下頜前磨牙，刮取根中1/3牙周膜組織，采用酶消化聯(lián)合組織塊法培養(yǎng)。消化液由3 mg/mlⅠ型膠原酶和4 mg/ml中性蛋白酶以體積比1∶1混合而成。
　　 2、人PDLC來(lái)源鑒定通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞

10、的波形絲蛋白和角蛋白的表達(dá)，對(duì)細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行初步鑒定。
　　 3、繪制人PDLC生長(zhǎng)曲線用MTS試劑測(cè)定并繪制培養(yǎng)的人PDLC生長(zhǎng)曲線。
　　 結(jié)果:
　　 1、形態(tài)學(xué)特征:原代培養(yǎng)第5d即可看到細(xì)胞從組織塊游出，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別，多數(shù)呈長(zhǎng)梭形，少數(shù)為多角形，紡錘狀，體積較小，內(nèi)有圓形細(xì)胞核。原代培養(yǎng)12d細(xì)胞即達(dá)到80％匯合，此時(shí)細(xì)胞連接成片，排列具有一定的方向性，呈漩渦狀。經(jīng)HE染色可見(jiàn)細(xì)胞核呈圓形藍(lán)染，胞質(zhì)

11、紅染。
　　 2、免疫組織化學(xué)特征:免疫組化顯示細(xì)胞抗波形絲蛋白染色陽(yáng)性，胞質(zhì)內(nèi)有褐色陽(yáng)性顆粒均勻分布，向抗角蛋白染色陰性，胞質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)褐色陽(yáng)性顆粒，表明細(xì)胞較為單一，符合間葉來(lái)源細(xì)胞特征，且無(wú)上皮細(xì)胞污染，證實(shí)所分離培養(yǎng)的是人PDLC，可用于進(jìn)一步的研究。
　　 3、生長(zhǎng)曲線特點(diǎn):經(jīng)MTS法測(cè)得的人PDLC生長(zhǎng)曲線顯示，細(xì)胞接種后48 h內(nèi)生長(zhǎng)緩慢，此后細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸加快，第3d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第7d進(jìn)入平臺(tái)期。
　

12、　 第二章、改良HBSS液對(duì)體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞增殖活性的影響
　　 目的:以HBSS液為基礎(chǔ)液配制成改良HBSS液，用MTS法檢測(cè)改良HBSS液保存的體外培養(yǎng)人PDLC增殖活性的變化。
　　 方法:
　　 1、在HBSS液中添加終濃度各為100 U/ml的青霉素和鏈霉素，無(wú)水酒精溶解地塞米松后加入HBSS液中使其終濃度為8 mg/L。將上述HBSS液充分混勻后分成三等份，分別添加GSH使其終濃度分別為1 mm

13、ol/L、3mmol/L和5 mmol/L，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值在7.2-7.4之間，最后過(guò)濾消毒待用。
　　 2、取生長(zhǎng)良好的第4代人PDLC鋪于96孔板，用MTS法測(cè)定人PDLC于室溫(25℃)下在上述三種改良HBSS液、HBSS液、HC-A離體腎保存液及蒸餾水中存放0.5～48 h后的增殖活性變化。
　　 結(jié)果:
　　 MTS法檢測(cè)結(jié)果顯示:HBSS液組和改良HBSS液組的細(xì)胞增殖活性（OD值）在0.5

14、～48 h內(nèi)均顯著高于HC-A液組和蒸餾水組(P＜0.05)，HC-A液組和蒸餾水組之間差異始終無(wú)顯著意義(P＞0.05);含3 mmol/L和5mmol/LGSH的改良HBSS液組在1～12h顯著高于HBSS液組(P＜0.05);含1mmol/LGSH的改良HBSS液組在2～6 h顯著高于HBSS液組(P＜0.05)，其中，含5 mmol/LGSH改良HBSS液組在2～12h顯著高于含GSH的其它濃度組(P＜0.05)。但含1 mmo

15、l/LGSH的改良HBSS液組在1h、12h時(shí)與HBSS液組差異無(wú)顯著意義(P＞0.05);另外，改良HBSS液組與HBSS組在24～48 h間均差異無(wú)顯著意義(P＞0.05)。
　　 第三章、改良HBSS液對(duì)體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞存活和克隆能力的影響
　　 目的:用臺(tái)盼藍(lán)染色法和細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)改良HBSS液保存體外培養(yǎng)人PDLC的效果。
　　 方法:
　　 1、取生長(zhǎng)良好的第4代人PDLC，在上

16、述三種改良HBSS液、HBSS液及蒸餾水中保存0.5～48 h后，用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定活細(xì)胞與死細(xì)胞，并計(jì)算存活細(xì)胞百分率。
　　 2、未用于臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，以50，100，200個(gè)細(xì)胞的密度分別接種至含2.5 ml37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)至肉眼能看到克隆時(shí)終止培養(yǎng)，并計(jì)算存活細(xì)胞克隆形成率。
　　 結(jié)果：
　　 1、存活細(xì)胞百分率:含3 mmol/L和5mmol/L GSH的改良H

17、BSS液組在2～24 h顯著高于HBSS液組，且含5 mmol/L GSH的改良HBSS液組在2～24 h時(shí)顯著高于含1 mmol/L GSH的改良HBSS液組(P＜0.05)，含3 mmol/L GSH的改良HBSS液組在6～24 h顯著高于含1mmol/L GSH的改良HBSS液組(P＜0.05);含3 mmol/L和5mmol/L GSH組之間差異始終無(wú)顯著意義(P＞0.05);含1 mmol/L GSH的改良HBSS液與HBSS

18、液組之間差異始終無(wú)顯著意義（P＞0.05）;改良HBSS液組和HBSS液組在0.5、1h及48 h時(shí)差異始終無(wú)顯著意義（P＞0.05）。而蒸餾水組在0.5h時(shí)已無(wú)細(xì)胞存活。
　　 2、存活細(xì)胞克隆形成率:含5 mmol/L GSH的改良HBSS液組在1～12h顯著高于HBSS液組（P＜0.05），在2～12h顯著高于含1 mmol/L GSH的改良HBSS液組(P＜0.05)，在6～12 h時(shí)顯著高于含3mmol/L GSH的改

19、良HBSS液組(P＜0.05);含3 mmol/L GSH的改良HBSS液組在1～6 h顯著高于HBSS液組(P＜0.05)，僅在2h時(shí)顯著高于含1mmol/L GSH的改良HBSS液組（P＜0.05）;含1 mmol/L GSH的改良HBSS液僅在6h時(shí)顯著高于HBSS液組(P＜0.05); HBSS液組和改良HBSS液組的克隆形成率在0.5、24 h及48 h時(shí)差異始終無(wú)顯著意義（P＞0.05）。
　　 結(jié)論：