MicroRNAs調(diào)節(jié)肺癌細胞生物學行為的研究.pdf

1、研究背景：肺癌是癌癥相關(guān)死亡的第一位原因，而且是近年來發(fā)病率上升最快的腫瘤之一。發(fā)達國家中肺癌病人總的5年生存率在過去的幾十年間始終徘徊在10％左右。肺癌患者預(yù)后不良的一個重要原因是其具有容易復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的特性。臨床資料表明，即使是IA期的患者在腫瘤完全切除后也大多死于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，深入闡明肺癌發(fā)生、發(fā)展的機制，尤其如何預(yù)防、治療肺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是改善病人預(yù)后的關(guān)鍵，也是近年來研究的熱點之一。
　　 MicroRNA(mi

2、RNA)是近年發(fā)現(xiàn)的、小的、不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA。其主要生理功能包括調(diào)控細胞和器官的生長、發(fā)育；調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡；參與代謝和應(yīng)激反應(yīng)等?，F(xiàn)已明確miRNA是通過在轉(zhuǎn)錄和(或)翻譯水平負調(diào)控靶基因而發(fā)揮各種生理、病理作用。研究提示miRNA可能參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，包括侵襲與轉(zhuǎn)移；其機制可能與miRNA和各種信號傳導通路的相互作用有關(guān)。然而，該方面的工作還處于起步階段，需要深入、全面地研究；而且，截止目前未見有關(guān)miRNA與

3、肺癌轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究。
　　 研究目的：
　　 1.了解miRNA是否參與肺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的調(diào)控；
　　 2.了解miRNA調(diào)控肺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機制；
　　 3.了解肺癌細胞中miRNA的表達是否與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)信號通路的活化有關(guān)；
　　 4.探討EGFR信號通路相關(guān)的miRNA的功能。
　　 研究方法：

4、>　　 1.應(yīng)用miRNA芯片和實時定量RT-PCR了解高、低轉(zhuǎn)移巨細胞肺癌細胞801D和95C之間miRNA的差異表達以及篩選EGFR信號通路相關(guān)的miRNA；
　　 2.miRNA的功能分析
　　 Transwell Insert、體外劃痕愈合實驗、微管形成實驗、增殖和凋亡分析、細胞周期分析等了解miRNA對肺癌細胞生物學行為的影響。
　　 3.生物信息學方法預(yù)測及Western Blot和熒光素酶報告基因

5、試驗驗證其對靶基因的調(diào)控作用。
　　 4.基因芯片檢測及Gene Otology(GO)分析miRNA對腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達的影響；
　　 研究結(jié)果：
　　 1.巨細胞肺癌細胞中miR-183的表達
　　 MiRNA芯片檢測顯示在高轉(zhuǎn)移巨細胞肺癌細胞801D和低轉(zhuǎn)移巨細胞肺癌細胞95C之間共有92個miRNA的表達存在顯著差異。其中miR-183是差異最明顯的miRNA之一。實時定量RT-PCR證實80I

6、D細胞中miR-183的表達水平明顯低于95C。
　　 2.miR-183對肺癌細胞的遷移和侵襲能力的影響
　　 Transwell Insert實驗顯示80ID細胞轉(zhuǎn)染miR-183后，遷移的細胞數(shù)和侵襲的細胞數(shù)都明顯較對照組減少。體外劃痕愈合實驗也顯示轉(zhuǎn)染miR-183后801D細胞的創(chuàng)傷愈合能力降低，自劃痕24小時后達到統(tǒng)計學意義。
　　 3.熒光素酶基因報告實驗及熒光素酶活性測定
　　 3個最常用

7、的數(shù)據(jù)庫(TargetScan，PicTar and miRanda)均預(yù)測Ezrin蛋白的編碼基因VIL2可能是miR-183調(diào)控的靶基因。Western Blot結(jié)果證實轉(zhuǎn)染外源性miR-183可以完全抑制801D細胞Ezrin蛋白的表達。為了探討miR-183是否是否直接調(diào)節(jié)Ezrin表達，我們將含有miR-183結(jié)合位點的VIL2 mRNA3'UTR序列克隆并連接入熒光素酶基因報告載體pGL3中。將該重組質(zhì)粒和miR-183共轉(zhuǎn)

8、染到801D細胞，結(jié)果顯示miR-183可以明顯抑制重組質(zhì)粒的熒光素酶活性。
　　 4.Affymetrix芯片檢測及GO分析結(jié)果
　　 Affymetrix U133 plus2芯片檢查發(fā)現(xiàn)共424個基因mRNA的表達受miR-183影響：其中258個下調(diào)，166上調(diào)。功能分類結(jié)果表明9.69％(25/258)的下調(diào)基因和7.23％(12/166)的上調(diào)基因分別與細胞黏附、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。其中包括具有促乳腺癌細胞

9、轉(zhuǎn)移的CCL5；可以促進黑色素瘤轉(zhuǎn)移的CTHRCI以及與胃癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的CYR61等。
　　 5.EGFR信號通路相關(guān)miRNA的篩選及驗證結(jié)果
　　 用P值<0.01做為表達差異的篩選標準，表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)刺激后肺癌細胞中共有39個miRNA表達發(fā)生明顯改變：9個上升、30個下降。其中的5個miRNA---let-7i、miR-24、miR-25、miR-29b和mi

10、R-125a-5p的表達能被gefitinib(EGFR酪氨酸激酶抑制劑)逆轉(zhuǎn)。因此，我們推測該5個miRNA可能與EGFR信號通路相關(guān)。實時定量RT-PCR檢測顯示：除let-7i外，其余4個miRNA的表達均明顯受EGF刺激的影響(miR-25、miR-29b表達升高；而miR-125a-5p和miR-24表達降低)，且能被gefitinib逆轉(zhuǎn)；其中以miR-125a-5p改變最明顯。
　　 6.miR-125a-5p的功

11、能分析結(jié)果
　　 轉(zhuǎn)染miR-125a-5p抑制物后PC9細胞的增殖能力、遷移、侵襲細胞數(shù)明顯較陰性對照和空白對照組增加；同時明顯促進臍靜脈內(nèi)皮細胞的血管形成能力；而對PC9細胞的凋亡、細胞周期無明顯影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.高、低轉(zhuǎn)移巨細胞肺癌80ID和95C之間miRNA表達譜存在顯著的差異；80ID細胞中miR-183的表達明顯低于95C細胞；
　　 2.miR-183可能參與肺癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控；