富馬酸二甲酯和低氧誘導(dǎo)因子-1α關(guān)系研究.pdf

1、研究背景:研究已經(jīng)表明，骨折和骨骼的失載荷（失重力）能誘導(dǎo)骨細(xì)胞缺氧[1，2]?，F(xiàn)已證明，其中，低氧誘導(dǎo)因子-1a(HIF-1a)是一種組織細(xì)胞低氧環(huán)境的分泌表達(dá)的重要分子，可以誘導(dǎo)多種炎性介質(zhì)的表達(dá)，是機(jī)體在低氧狀態(tài)下調(diào)劑機(jī)體功能的一種重要氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子，介導(dǎo)骨折及骨骼失載荷中多種炎性因子的釋放，對于骨折愈合及骨質(zhì)疏松是一種不利因素。其可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、葡萄糖受體及促紅細(xì)胞生成素(EPO)生成，激活炎癥因子的表

2、達(dá)，誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的形成，調(diào)控細(xì)胞的凋亡及分化?，F(xiàn)已證明，缺氧可以上調(diào)幾個重要基因的表達(dá)，包括可以促進(jìn)新血管的形成和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)。椎間盤退變亦能出現(xiàn)HIF-1α的高表達(dá)。富馬酸二甲酯(DMF)是最近批準(zhǔn)的用于多發(fā)性硬化癥的一線治療藥物，它有良好的特征性的保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)細(xì)胞作用。DMF可以調(diào)節(jié)不同類型的細(xì)胞中的免疫系統(tǒng);是一種口服片劑，人們認(rèn)為它是通過降低NF-κB依賴的基因的表達(dá)起

3、作用的。缺氧時都會發(fā)生促炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，但是，有關(guān)DMF在缺氧時的生理作用，尤其是對HIF-1α的表達(dá)和功能的調(diào)節(jié)方面的信息在過往研究中卻鮮有報道。本研究中，我們期待證明DMF是一種新型的HIF-1α表達(dá)功能抑制劑。進(jìn)而對于骨折、骨質(zhì)疏松、椎間盤退變的治療提出一種新的思路。
　　我們實(shí)驗(yàn)分成兩部分來進(jìn)行:一、富馬酸二甲酯抑制成骨細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的表達(dá)及其功能。富馬酸二甲酯對椎間盤髓核中低氧誘導(dǎo)因子-1a分

4、泌及表達(dá)的影響。
　　第一部分
　　富馬酸二甲酯抑制成骨細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的表達(dá)及其功能
　　目的:探討富馬酸二甲酯(DMF)在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞HIF-1α表達(dá)和功能中所起的功能和作用。
　　方法:在添加了10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素和鏈霉素(P/S)的α-基礎(chǔ)培養(yǎng)基(α-MEM)中培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1(克隆14)。缺氧處理前分別在蛋白酶體抑制劑MG132或N-乙?；?亮氨酰-

5、亮氨酰-正亮氨酸(N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal，ALLN)存在和不存在的情況下，用范圍在10-100μM之間的不同濃度的DMF處理細(xì)胞。然后分別在1％或21％氧張力下進(jìn)行不同時間的預(yù)處理（1-24小時），用含有0.1％ FBS和1％ P/S的α-MEM更換培養(yǎng)基。對于環(huán)境(21％)氧張力實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞在濕潤的培養(yǎng)箱中，37℃，95％空氣，5％ CO2的條件下培養(yǎng)。對于缺氧實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞在濕潤的培養(yǎng)箱中，3

6、7℃，5％CO2，氧張力降到1％，補(bǔ)充N2的條件下培養(yǎng)。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)合成的cDNA對MC3T3 E1細(xì)胞中VEGF和IL-8的表達(dá)進(jìn)行研究。使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫沉淀和Western免疫印跡分析測定蛋白質(zhì)濃度，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測VEGF、IL-8，采用HIF-1α脈沖標(biāo)記方法對放射性標(biāo)記的HIF-1α蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用HydroTech干膠設(shè)備(Bio

7、-Rad Laboratories，USA)干膠，然后放射自顯影。通過上述方法探討富馬酸二甲酯(DMF)對HIF-1α表達(dá)和功能的影響，對HIF-1α及其目標(biāo)基因表達(dá)及影響。
　　結(jié)果:在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，DMF可以抑制成骨細(xì)胞中因缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α及其目標(biāo)基因，如白介素8(IL-8)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在MC3T3E1細(xì)胞中的表達(dá)。DMF以蛋白酶依賴、von Hippel-Lindau(VHL)蛋白不依賴的方式促

8、進(jìn)HIF-1α的降解。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)DMF打斷HIF-1α和它的分子伴侶熱休克蛋白90(Hsp90)之間的相互作用，但可以促進(jìn)HIF-1α和激活的蛋白酶C(RACK1)受體之間的相互作用。這些數(shù)據(jù)顯示，DMF可能通過影響HIF-1α蛋白的折疊和成熟從而促進(jìn)其降解。
　　結(jié)論:HIF-1α在成骨細(xì)胞缺氧中表達(dá)明顯增高。DMF是一種新型的HIF-1α抑制劑，它可通過改變與伴侶蛋白Hsp90和RACK1的功能性相互作用來抑制成骨細(xì)胞

9、中的HIF-1α。我們的研究讓人們對DMF在骨折及骨質(zhì)疏松癥成骨細(xì)胞缺氧過程中的藥理作用有了更深一步的了解。為治療骨折及骨質(zhì)疏松癥提供了一種新的思路。
　　第二部分
　　富馬酸二甲酯對椎間盤髓核中低氧誘導(dǎo)因子-1 a分泌及表達(dá)的影響
　　目的:建立SD大鼠腰椎間盤退變動物模型，在此基礎(chǔ)上采用影MRI、組織學(xué)驗(yàn)證退變模型的可靠性，免疫組織化學(xué)、免疫印跡等實(shí)驗(yàn)方法測定HIF-1a在椎間盤髓核中的表達(dá)及作用，探討富馬酸二甲酯

10、對其表達(dá)及分泌的影響。
　　方法:實(shí)驗(yàn)研究對象為SD大鼠，48只大鼠按照設(shè)計隨機(jī)分為三組，正常對照組A組（無任何干預(yù)措施）、模型對照組B組（單純行動物模型處理）、模型實(shí)驗(yàn)組富馬酸二甲酯組C組（建立模型后口服富馬酸二甲酯），每組16只。實(shí)驗(yàn)組采用手術(shù)方式建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?麻醉成功后切除L1-L6棘上韌帶、棘間韌帶及兩側(cè)豎棘肌，咬骨鉗咬除棘突、關(guān)節(jié)突，建立腰椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)動物模型。動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑿g(shù)后2周開始給藥，富馬酸二甲酯組C組給予

11、50mg/kg/d灌胃給藥，持續(xù)給藥6周，模型對照組B組給予等體積的生理鹽水，正常對照組A組未行任何干預(yù)措施。于術(shù)后8周將全部的SD大鼠麻醉后行腰椎MRI掃描，掃描后使用組織病理、免疫組織化學(xué)及免疫印跡等實(shí)驗(yàn)方法對椎間盤組織進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:通過此種手術(shù)方法建立腰椎間盤退變動物模型確實(shí)可靠，MRI顯示模型對照組及富馬酸二甲酯椎間盤退變明顯，T2信號減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。組織病理學(xué)結(jié)果顯示模型對照組，外周纖維環(huán)

12、出現(xiàn)纖維樣變，髓核細(xì)胞的數(shù)目減少，終板退變。透射電鏡下觀察結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中較對照組髓核細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞突起減少或消失，糖原顆粒及細(xì)胞器數(shù)目在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯減少，膠原原纖維發(fā)生變性、融合，甚至鈣化。免疫組化顯示椎間盤髓核組織中富馬酸二甲酯組HIF-1a表達(dá)呈陽性，與模型對照組及正常對照組有顯著性差異(P＜0.05)。蛋白印跡檢測結(jié)果富馬酸二甲酯組HIF-1a表達(dá)水平較模型對照組低，有顯著性差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:H