FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7在HCV患者中及干擾素作用肝細胞后的表達研究.pdf

1、背景與目的： 丙肝是一種嚴重危害人類健康的疾病，全球約1.7億人口感染丙型肝炎病毒[1]，干擾素聯(lián)合利巴韋林是目前最有效的治療方法，但其持續(xù)性應答療效并不很理想，療程長，且藥物的不良反應比較明顯，費用較高，其中HCV基因2型、3型患者的SVR率接近80％，而HCV基因1型患者的SVR率只有50％[2]，我國主要以基因1b型為主[3]，研究開發(fā)高效抗HCV藥物是目前的當務之急。 HCV不同的基因分型及高變異率導致易出現(xiàn)耐

2、藥問題，使得以HCV為靶點的抗病毒治療研究進入瓶頸，隨著對HCV感染復制過程認識的不斷深入，揭示宿主基因在HCV的入侵、復制、包裝、釋放等過程中起了不可或缺的角色[4-6]，且宿主基因較穩(wěn)定不存在高變異率，以宿主基因為藥物靶標可克服因病毒變異導致的耐藥問題，但目前研究的相關基因對宿主本身來說作為治療靶標會導致嚴重的毒副作用，理想的抗病毒藥物應為在不損傷宿主細胞的前提下特異性抑制清除病毒。進一步深入研究病毒與宿主的相互作用可為研發(fā)新的抗病

3、毒藥物提供思路。 隨著HCV體外模型的不斷改進及分子生物技術的進步，近幾年陸續(xù)在體外發(fā)現(xiàn)了一些新的宿主基因在HCV復制中起到不可或缺的作用，其中c—myc原癌基因遠端結合蛋白(FBP)、Rab—GTP酶激活蛋白(TBC1D20)、血栓素A2受體(TBXA2R)、蛋白激酶(MKK7)在HCV復制中發(fā)揮重要作用[7-9]，但其本身及其與HCV的相關研究報道較少，闡明HCV與上述宿主基因之間相互作用的分子機制，不僅加深對HCV生物學的

4、了解同時更為病毒的防治提供一些新思路。病毒感染性疾病是病毒與宿主細胞相互作用的結果，一方面病毒通過宿主內環(huán)境完成感染復制，另一方面宿主啟動一系列抗病毒通路抑制清除感染入侵的病原體。因此人為抑制HCV復制的宿主基因的表達或是上調體內不同的抗病毒通路的表達都可為發(fā)現(xiàn)新的抗HCV提供前景。HCV感染宿主后將引起宿主基因表達發(fā)生改變，抗病毒治療應根據(jù)宿主細胞病變基因表達水平的異常狀況，采取不同的策略，以提高或補足表達水平低下的基因，或降低表達水

5、平過高的基因，或對在正常狀況下不表達的基因進行封閉或破壞?；诖耍覀冄芯縃CV感染復制對幾種宿主HCV復制相關基因(FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7)表達的影響，可為制定針對宿主的抗病毒治療策略提供理論依據(jù)。 干擾素聯(lián)合利巴韋林是目前最有效的抗HCV方法，但具體機制未明，國內外有文獻報道干擾素可調節(jié)多種宿主基因的表達，從而實現(xiàn)抗增生、抗腫瘤、免疫調節(jié)等多種生物學功能，干擾素是機體防御系統(tǒng)的重要研究對象，因此研究干

6、擾素及利巴韋林對FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7等基因表達的調控，可以深入闡明干擾素抗病毒機制同時有利于發(fā)現(xiàn)體內新的抗病毒靶點。 本課題研究旨在初步探討HCV RNA在患者PBMC中的存在情況，在此基礎上進一步檢測幾種HCV復制相關宿主基因在患者PBMC中的表達水平，同時在體外觀察干擾素及利巴韋林對FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7表達的影響，為制定針對宿主基因的抗病毒治療策略提供理論依據(jù)。

7、方法： 1、定量檢測40例HCV患者PBMC中HCV RNA的表達情況 收集40例未用過抗病毒治療的HCV患者，分離患者PBMC，提取總RNA，合成cDNA第一鏈，進行SYBR Green Realtime PCR擴增反應，統(tǒng)計計算患者PBMC中HCV RNA的載量及與血清中HCV RNA載量的相關性。 2、定量檢測30例HCV患者及15例健康對照PBMC中FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7宿主基因的

8、表達情況 從上述40例HCV患者中選取30例未用過抗病毒治療的患者，按CHC及LC分為兩組，每組各15例，另設健康對照組15例，分離PBMC，提取總RNA，合成cDNA第一鏈，進行SYBR Green Realtime PCR擴增反應，統(tǒng)計計算每例標本PBMC中FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7的表達情況，結合臨床資料分析三組中上述基因表達是否存在差異及與臨床資料的相關性。 3、定量檢測20例HCV患者PBM

9、C中IRF—3、IRF—7、IFN—γ、JAK-1及USP18的表達情況 從上述CHC及LC兩組中分別隨機抽取10例患者，用上述方法定量檢測PBMC中IRF—3、IRF—7、IFN—γ、JAK-1及USP18mRNA水平。 4、檢測干擾素—2α及利巴韋林作用HEPG2細胞株前后FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7的表達情況 體外培養(yǎng)人肝癌細胞株HepG2，將處理藥物分成三組：干擾素—2α、利巴韋林及干擾

10、素—2α聯(lián)合利巴韋林，分別以不同濃度和不同時間作用于HepG2細胞，提取總RNA，合成cDNA第一鏈，進行SYBR Green Realtime PCR擴增反應，統(tǒng)計計算給予不同處理的HepG2細胞株中FBP、TBC1D20、TBXA2R、MKK7基因的表達情況。 結果： 1、40例抗HCV陽性的患者中35例血清HCV RNA陽性，5例血清HCV RNA陰性，35例血清HCVRNA陽性的患者中30例PBMCs中可測定到H

11、CVRNA，而5例血清HCV RNA陰性的患者中2例PBMCs中檢測到HCVRNA。統(tǒng)計結果示患者外周血清中HCV RNA載量與PBMCs中HCV RNA載量無相關性(P>0.05)。 2、FBP、TBC1D20 mRNA在CHC及LC組PBMCs中表達較健康對照組增高，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但在CHC和LC兩組比較未見顯著差異(P>0.05)。在CHC、LC及健康對照三組中未觀察到PBMC中MKK7、TBXA2R mR

12、NA表達水平存在顯著差異(P>0.05)。統(tǒng)計分析HCV患者外周血PBMCs中FBP、TBC1D20 mRNA的表達水平與患者肝功能、HCVRNA載量及IRF—3、IRF—7、IFN—γ、JAK、USP18等表達水平均未見相關性(P>0.05)。 3、干擾素—2α作用HePG2細胞引起TBC1D20 mRNA表達下調，且觀察到劑量依賴型(P<0.05)，即隨著干擾素劑量的加大TBC1D20 mRNA表達顯著下調。未觀察到干擾素—

13、2α影響FBP、TBXA2R、MKK7mRNA的表達水平(P>0.05)。本研究結果沒有顯示利巴韋林影響TBC1D20、FBP、TBXA2R、MKK7等的表達水平，亦未觀察到利巴韋林與干擾素在下調TBC1D20 mRNA表達上有協(xié)同作用(P>0.05)。 結論： 1、HCV患者PBMCs中可測定到HCV RNA，血清中HCV RNA載量與PBMCs中HCV RNA載量無相關性。 2、FBP、TBC1D20mRNA