干擾素-λ在人神經(jīng)細胞內(nèi)的表達、調(diào)節(jié)及抗病毒作用.pdf

1、干擾素-λ (Interferon-λ，IFN-λ)，又稱Ⅲ型干擾素，是干擾素家族的新成員，包括IFN-λ1，IFN-λ2和IFN-λ3，主要在抗原提呈細胞中表達。病毒感染或Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)激動劑的刺激均能上調(diào)IFN-λ的表達。IFN-λ與其受體復(fù)合物IL-28Rα/IL-10Rβ結(jié)合后導(dǎo)致Jak-Stat信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活，發(fā)揮類似Ⅰ型干擾素的抗病毒、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能。
　　

2、 目前，關(guān)于IFN-λ的研究主要集中在免疫系統(tǒng)，關(guān)于其在神經(jīng)系統(tǒng)的表達和作用，國內(nèi)外報道甚少。本研究應(yīng)用細胞與分子生物學、病毒學及免疫學相關(guān)技術(shù)探討IFN-λ及其受體在人神經(jīng)細胞中的表達、TLR活化對IFN-λ的調(diào)節(jié)以及IFN-λ在神經(jīng)細胞內(nèi)抗病毒功能及機制。本研究為揭示IFN-λ在人神經(jīng)元抗病毒天然免疫中的作用提供了直接的實驗依據(jù)，也為人類免疫缺陷病毒I型(Human Immunodeficiency Virus-1，HIV-1)引

3、起的神經(jīng)精神異常及單純皰疹病毒I型（Herpes Simplex Virus-1，HSV-1）腦病的藥物治療提供新線索。
　　 一、人神經(jīng)細胞表達IFN-λ及其受體為了明確人神經(jīng)細胞是否表達IFN-λ，我們首先檢測了不同類型神經(jīng)細胞內(nèi)源性IFN-λ的表達水平。正常人腦組織、人原代大腦皮質(zhì)神經(jīng)元、NT2-N神經(jīng)元以及神經(jīng)瘤細胞系SH-SY5Y，CHP212均可表達IFN-λ1，但不表達IFN-λ2/3。隨著NT2-N神經(jīng)元的分化成

4、熟，IFN-λ1表達量逐漸升高，而IFN-λ2/3表達一直呈陰性。正常人腦組織及人神經(jīng)細胞也表達IFN-λ受體復(fù)合物IL-28Rα/IL-10Rβ。隨著神經(jīng)細胞的分化成熟，這兩種受體亞單位的表達水平逐漸增高。
　　 二、TLR-3活化誘導(dǎo)人神經(jīng)細胞表達IFN-λ
　　 TLR是近來發(fā)現(xiàn)的一類細胞跨膜受體，在識別病原體模式分子、啟動天然免疫應(yīng)答作用中發(fā)揮重要作用。人原代神經(jīng)元、NT2-N神經(jīng)元和神經(jīng)細胞系表達所有功能性的T

5、LR（TLR1-10）。利用TLR-3激動劑聚肌苷酸胞苷酸（Polyriboinosinic polyribocytidylic acid，PolyI:C)活化TLR-3能特異性增強IFN-λ在神經(jīng)元中的表達，這種TLR-3介導(dǎo)的IFN-λ的誘導(dǎo)具有劑量和時間依賴關(guān)系。此外，TLR-3介導(dǎo)的激活是特異性的，因為TLR-4，5，7，8，9激動劑對IFN-λ1和IFN-λ2/3的表達均無影響。
　　 三、IFN-λ抑制人神經(jīng)細胞內(nèi)H

6、SV-1復(fù)制為了明確IFN-λ能否抑制嗜神經(jīng)DNA病毒HSV-1，我們在病毒復(fù)制的不同階段檢測IFN-λ對HSV-1感染的抑制作用。結(jié)果顯示HSV-1感染后神經(jīng)細胞出現(xiàn)明顯的圓縮、聚集及空泡狀改變，隨著感染時間的延長，神經(jīng)細胞內(nèi)病毒DNA含量逐漸增多，提示HSV-1可以在以上人神經(jīng)細胞模型內(nèi)復(fù)制。熒光實時定量PCR分析顯示：與I型IFN類似，IFN-λ1和IFN-λ2均抑制人神經(jīng)細胞內(nèi)HSV-1的DNA復(fù)制，且抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量和時

7、間依賴性；免疫熒光化學結(jié)果則顯示IFN-λ1或IFN-λ2處理的感染細胞內(nèi)HSV-1 包膜糖蛋白D（glycoprotein D，gD）免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物較未處理組明顯減弱，提示IFN-λ抑制HSV-1 gD蛋白合成?？笽L-10Rβ中和抗體能部分阻斷IFN-λ1和IFN-λ2的抗HSV-1作用，證實IFN-λ通過其特異性受體而發(fā)揮抗HSV-1效應(yīng)。
　　 四、IFN-λ抑制神經(jīng)細胞內(nèi)HIV復(fù)制為了進一步揭示IFN-λ在人神經(jīng)細胞

8、的抗病毒功能，我們檢測IFN-λ是否抑制人神經(jīng)細胞內(nèi)HIV-1復(fù)制。因為HIV-1不能直接感染人神經(jīng)細胞，所以我們利用假型HIV-1進行感染。假型HIV-1是由HIV-1骨架基因融合熒光素酶基因，外包鼠白血病病毒包膜制備而成。它能感染任何類型的細胞。利用底物檢測熒光素酶活性可以反映HIV-1在細胞中的復(fù)制狀態(tài)。我們的研究發(fā)現(xiàn)IFN-λ1和IFN-λ2可抑制人神經(jīng)細胞內(nèi)HIV-1的復(fù)制和誘導(dǎo)細胞內(nèi)抗HIV因子-胞嘧啶脫氨酶-3G（apol

9、ipoprotein B mRNA editing enzyme 3G，Apobec3G）和Apobec3F的表達，提示IFN-λ的抗HIV-1效應(yīng)可能由Apobec3G/F介導(dǎo)。
　　 TLR-3活化在特異性誘導(dǎo)IFN-λ表達的同時，也可以抑制假型HIV-1的復(fù)制，且抑制效應(yīng)具有明顯的劑量依賴關(guān)系。為了明確細胞內(nèi)誘導(dǎo)的IFN-λ是否具有抗病毒活性，我們檢測IFN-λ在TLR-3介導(dǎo)的抗HIV-1效應(yīng)中的作用。利用抗IL-10R

10、β中和抗體阻斷內(nèi)源性IFN-λ作用，再用PolyI:C活化TLR-3，觀察PolyI:C對HIV-1的抑制效應(yīng)是否降低。結(jié)果顯示，抗IL-10Rβ抗體阻斷明顯降低TLR-3介導(dǎo)的抗HIV-1效應(yīng)，提示神經(jīng)細胞內(nèi)IFN-λ參與TLR-3介導(dǎo)的抗病毒作用。
　　 五、IFN-λ激活I(lǐng)FN-a 通路I型干擾素是宿主抗病毒天然免疫最重要的細胞因子之一。病毒通過活化TLR誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子（IFN regulatory factors，I

11、RF)產(chǎn)生，IRF經(jīng)磷酸化入核，結(jié)合于I型干擾素反應(yīng)元件，導(dǎo)致I型干擾素基因表達。I型干擾素分泌出細胞后與其受體結(jié)合，經(jīng)過Jak-Stat信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因（IFN stimulated genes，ISGs）的表達，幫助宿主建立抗病毒狀態(tài)。為了探討IFN-λ可能涉及的抗病毒機制，我們觀察了IFN-λ對I型IFN通路的影響，包括IFN-λ是否誘導(dǎo)TLRs、IRFs、IFN-a、IFN-β以及ISGs。熒光實時定量PC

12、R結(jié)果顯示，IFN-λ1和IFN-λ2均可誘導(dǎo)人NT2-N神經(jīng)元內(nèi)TLR-3和9、IRF-7及IFN-a表達，但對其它TLR、IRF及IFN-β的表達無影響。對于檢測的所有ISGs包括MxA、OAS-1、PKR、ISG56，IFN-λ均有誘導(dǎo)作用。以上結(jié)果表明IFN-a通路的激活可能是IFN-λ的抗病毒機制之一。
　　 結(jié)論：人神經(jīng)細胞表達IFN-λ1，而不表達IFN-λ2/3；人神經(jīng)細胞也表達IFN-λ受體復(fù)合物IL-28Rα