siRNA干擾ski的表達(dá)以及對(duì)人肝癌HepG-,2-細(xì)胞生物學(xué)功能影響的研究.pdf

1、ski是Stavanezer等人于1986年首先在感染了禽類(lèi)白血病轉(zhuǎn)化缺陷病毒Bratislava77的雞胚細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。它在不同類(lèi)型的細(xì)胞和組織中分布廣泛,尤其在多種腫瘤細(xì)胞中均存在著過(guò)量的異常表達(dá)。ski作為細(xì)胞內(nèi)的原癌基因,具有多種生物活性,參與體內(nèi)多種生理病理過(guò)程。對(duì)Ski蛋白生物活性及在各種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用機(jī)制的研究是目前生命科學(xué)領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。那么進(jìn)一步探索ski對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響對(duì)于上述命題則具有重要的意

2、義。 ski是TGF-β通路的主要負(fù)性調(diào)控因子,它通過(guò)抑制Smad家族復(fù)合物來(lái)拮抗TGF-β對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。 研究表明Ski蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用。由于其沒(méi)有內(nèi)在的催化活性,所以必須通過(guò)與其他細(xì)胞成分如Smad蛋白的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)這一功能,而TGF-βSmads傳導(dǎo)通路是已知與Ski致瘤作用關(guān)系最為密切的家族之一。同時(shí),大量臨床病例顯示,Ski在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用是復(fù)雜的：一方面

3、,在人類(lèi)許多腫瘤如惡性黑色素瘤、乳腺癌、食道癌、肺癌、胃癌、表皮樣瘤及前列腺癌中均已發(fā)現(xiàn)Ski的過(guò)量異常表達(dá),并被證實(shí)是食道癌、乳腺癌、大腸癌預(yù)后不良的重要因素之一；另一方面,Ski在少數(shù)情況下有一定的腫瘤抑制作用,如鼠ski的非等位缺失能提高其對(duì)化學(xué)誘癌的敏感性。Ski是TGF-β通路的主要負(fù)性調(diào)控因子,它在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的多樣性與TGF-β對(duì)腫瘤的雙重作用(早期抑制,中后期促進(jìn)侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移)之間是否存在著重大關(guān)系,是目前分子醫(yī)學(xué)急需攻

4、克的難題。 本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn),Ski在人肝癌HepG2細(xì)胞中異常高度表達(dá),表達(dá)量是人正常肝細(xì)胞LO2的18倍左右,提示Ski與肝癌的發(fā)生關(guān)系密切,所以ski有可能成為肝癌治療的新型靶點(diǎn)?？紤]到ski廣泛參與多種重要的生命活動(dòng),加之目前尚無(wú)關(guān)于ski與肝癌細(xì)胞增殖、凋亡等功能關(guān)系的報(bào)道,因此本課題著眼于ski對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能影響的研究。 鑒于RNA干擾技術(shù)是研究基因功能的強(qiáng)大工具,目前被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各項(xiàng)研

5、究。所以本課題選用針對(duì)ski的小分子RNA干擾片段瞬間轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞,剔降胞內(nèi)ski表達(dá)水平來(lái)監(jiān)控肝癌細(xì)胞生物學(xué)功能方面指標(biāo)的變化。相信這一研究將對(duì)腫瘤基因治療提供了一條新的思路和方法。 我們?cè)O(shè)計(jì)并化學(xué)合成針對(duì)原癌基因ski的3個(gè)siRNA分子序列,陽(yáng)離子脂質(zhì)體法瞬間轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR法和Western-Blotting法檢測(cè)細(xì)胞中ski在mRNA水平和蛋白水平的變化。然后利用MTT法和流式細(xì)胞儀檢

6、測(cè)轉(zhuǎn)染ski-siRNA的HepG2細(xì)胞的增殖、周期和凋亡等生物學(xué)功能方面指標(biāo)的變化。課題研究的內(nèi)容包括以下三個(gè)主要部分： 1.瞬間轉(zhuǎn)染hski-siRNA研究HepG2細(xì)胞中ski mRNA水平和蛋白水平的表達(dá); 2.siRNA干擾ski的表達(dá)對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞生物學(xué)功能的影響; 3.ski-siRNA對(duì)Ski下游周期相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié) 通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),三對(duì)特異性ski-siRNA均有效的抑制ski的

7、表達(dá),以siRNA-B抑制效果最好,可達(dá)到70％,而且隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng),ski的表達(dá)呈逐步下降趨勢(shì)。HepG2細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制(P<0.05),S期細(xì)胞明顯減少,是陰性對(duì)照組的2倍以上。但凋亡效果并不明顯。而且ski基因沉默后,TGF-β通路下游的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制因子p15,p27的蛋白表達(dá)隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)均明顯下調(diào),而p21蛋白的改變不大。因此可知,靶向ski基因的siRNA分子片段可以有效地抑制人肝癌HepG2