得力生協(xié)同5-FU誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG-,2-凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 從凋亡細(xì)胞形態(tài)、分子水平的研究，闡述中藥得力生(DLS)協(xié)同化療藥物氟尿嘧啶(5-FU)誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞(HepG2)凋亡的作用，初步探討DLS誘導(dǎo)HepG：凋亡的分子機(jī)制，為臨床聯(lián)用DLS治療肝癌提供理論依據(jù)，并為進(jìn)一步研究中西醫(yī)結(jié)合方法治療腫瘤提供理論依據(jù)。 方法： 1．細(xì)胞培養(yǎng)和凋亡模型建立：傳代培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，按照各實(shí)驗(yàn)要求及實(shí)驗(yàn)分組處理HepG2細(xì)胞從而建立凋亡模型。 2．MTT比色實(shí)

2、驗(yàn)：通過(guò)MTT比色法觀察DLS聯(lián)合5-Fu對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用及兩者聯(lián)合用藥效果。 3．細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：運(yùn)用倒置顯微鏡觀察未經(jīng)染色的HepG2細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化；采用熒光顯微鏡觀察經(jīng)Hoechst33258染色的HepG2細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。 4．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(FCM)：按實(shí)驗(yàn)分組處理HepG2細(xì)胞12h后，通過(guò)AnnexinV/PI雙染色FCM檢測(cè)HepG2細(xì)胞周期分布，并結(jié)合所觀察到的形態(tài)學(xué)改變分析凋亡率。

3、 5．原位末端標(biāo)記(TUNEL)：運(yùn)用TUNEL法在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的發(fā)生、對(duì)圖像進(jìn)行拍照并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI)。 結(jié)果： 1．MTT比色實(shí)驗(yàn)：MTT檢測(cè)表明DLS促進(jìn)5-FU對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖抑制作用，此作用呈明顯的時(shí)效及量效關(guān)系；單獨(dú)應(yīng)用5-FU和聯(lián)合DLS應(yīng)用的IC50分別為0.82μg/mL和0.32μg/mL，可見(jiàn)聯(lián)合用藥較單用IC50明顯降低；合并指數(shù)CI50為0.73，增效倍數(shù)為2

4、.56，說(shuō)明聯(lián)合用藥可產(chǎn)生協(xié)同作用。 2．細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)陰性對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，密集、核大，隱約可見(jiàn)多個(gè)核仁，用藥組細(xì)胞作用24h后，細(xì)胞體積變小、變圓，與鄰近細(xì)胞分離，胞漿濃縮；Hoechst染色后熒光觀察：陰性對(duì)照組細(xì)胞核染色均一、結(jié)構(gòu)完整，呈正常的藍(lán)色，用藥組表現(xiàn)出凋亡細(xì)胞特征性改變，其細(xì)胞核呈現(xiàn)致密濃染或碎片狀致密濃染，染色有些發(fā)白，出現(xiàn)核固縮，核裂解等現(xiàn)象。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，兩種觀察方法都顯示隨著

5、藥物濃度及時(shí)間增加這種現(xiàn)象更加明顯，而且同等條件下，聯(lián)合組現(xiàn)象更突出。 3．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)(FCM)：按實(shí)驗(yàn)分組處理HepG2細(xì)胞12h后，陰性對(duì)照組凋亡細(xì)胞僅占3.40％，并且未出現(xiàn)凋亡峰，藥物處理組均出現(xiàn)了凋亡峰。通過(guò)AnnexinV/PI雙染色FCM觀察各用藥組流式圖顯示，G1期前面均出現(xiàn)明顯的凋亡峰，并隨濃度的增加呈增加趨勢(shì)，而且隨著濃度增加G2/M期細(xì)胞的百分比逐漸增加，聯(lián)合用藥組阻滯在G2/M期更明顯。根據(jù)各組細(xì)胞直

6、方圖分析，5-FU組、DLS組、聯(lián)合A組、聯(lián)合B組、聯(lián)合C組凋亡率依次為21.30％、18.89％、22.01％、24.6％、39.2％，誘導(dǎo)凋亡作用呈量效關(guān)系，聯(lián)合后凋亡率明顯增加。 4．原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)：TUNEL陽(yáng)性信號(hào)表現(xiàn)為黃綠色的強(qiáng)熒光，位于胞核，呈環(huán)形、小圓形或顆粒狀，另外可見(jiàn)許多典型的“出泡”所形成的細(xì)胞，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，這種黃綠色的熒光強(qiáng)度變化呈量效關(guān)系，且用藥組AI值明顯升高。其它各組與陰性對(duì)

7、照組比較均有顯著差異(P＜0.01)，聯(lián)合A組與聯(lián)合C組與5-FU組比較均有顯著差異(P＜0.01)，聯(lián)合組與5-FU組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。 結(jié)論： 1．DLS不僅本身可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，而且能促進(jìn)5-Fu誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡；采用凋亡檢測(cè)方法可定性定量檢測(cè)HepG2細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 2．DLS、5-FU單用和聯(lián)用對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用呈良好的時(shí)間依賴(lài)性和劑量依賴(lài)性。