S100A2和S100A6對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和骨肉瘤細(xì)胞株MG63的生物學(xué)作用.pdf

1、腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素作用、多基因參與、經(jīng)歷多個(gè)階段的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，有許多信號(hào)分子參與其中。積極探討這些信號(hào)分子對(duì)細(xì)胞的作用和機(jī)制，及其信號(hào)分子之間的相互關(guān)系，將有助于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。S100蛋白家族是一類具有EF-手形結(jié)構(gòu)的信號(hào)分子，有25個(gè)成員，與鈣離子及其靶蛋白結(jié)合后發(fā)揮多種生理功能，參與細(xì)胞增殖和分化、鈣穩(wěn)態(tài)、蛋白質(zhì)磷酸化、酶活性和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。其中21個(gè)成員的基因定位于人染色體lq21，該區(qū)段染色體穩(wěn)定性差，易

2、發(fā)生多種染色體重排和基因擴(kuò)增?，F(xiàn)己發(fā)現(xiàn)多個(gè)S100成員在腫瘤中表達(dá)異常，并與腫瘤的增殖、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移和凋亡密切相關(guān)，S100A2和S100A6就是其中的兩個(gè)成員。 S100A2在多種腫瘤中表達(dá)減少或缺失，如惡性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤，且S100A2的缺失表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)，消減雜交也提示S100A2為腫瘤抑制因子；但也有相反報(bào)道。 S100A6蛋白最初由Kuznicki和Filipek在Ehrli

3、ch腹水瘤中檢出。它在多數(shù)上皮腫瘤(如黑色素瘤、肝癌、結(jié)直腸腫瘤、胰腺癌、膽管癌)、多數(shù)骨肉瘤、卵巢癌、ras轉(zhuǎn)化的MIH3T3細(xì)胞、SV4O轉(zhuǎn)化的鼠成纖維細(xì)胞和人急性粒細(xì)胞白血病等許多腫瘤中高表達(dá)，但它與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚不明確。 為了進(jìn)一步探討S100A2和S100A6對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用及其可能的機(jī)制，本課題擬通過(guò)重組蛋白直接作用的方式和/或腺病毒轉(zhuǎn)入基因的方式，研究人S100A2和S100A6對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和

4、人骨肉瘤細(xì)胞株MG63細(xì)胞的增殖、遷移、細(xì)胞周期和凋亡等的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。希望能夠?yàn)殛U明S100A2和S100A6對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)作用及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為發(fā)現(xiàn)腫瘤診斷和預(yù)后判斷的新標(biāo)志物以及腫瘤治療的新靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．hS100A2和hS100A6蛋白的鑒定和制備：雙酶切鑒定pGST-Moluc-hS100A2和pGST-Moluc-hS100A6后，將二者轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，異丙基

5、-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)S100A2和S100A6蛋白表達(dá)，谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠(Glutathione Sepharose 4B beads)分離純化、十二烷基磺酸鈉．聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)和Western blot鑒定這兩種重組蛋白，Bradford法定量，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?

6、 2．利用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增攜帶S100A6基因的重組腺病毒(ADS100A6)，并用SDS-PAGE/Western blot鑒定在感染了AdS100A6的HCT116中S100A6的表達(dá)。 3．GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)、GST-hS100A2、GST-hS100A6、表達(dá)GFP的重組腺病毒(AdGFP)、AdS100A6分別作用人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和人骨肉瘤細(xì)胞株MG63后(其中，蛋白終濃度為40μg/ml)

7、，分別用MTT法和臺(tái)盼蘭染色/細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)HCT116和MG63細(xì)胞的增殖情況；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期改變(PI染色)和凋亡的發(fā)生(AnnexinV-PE+細(xì)胞活性檢測(cè)試劑7AAD)；Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力；激光共聚焦技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)μ-catenin的變化。 結(jié)果 1．XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切pGST-Moluc-hS100A2和pGST-Moluc-hS100A6后，均出現(xiàn)約300bp和9kb的片

8、段，與其限制性內(nèi)切圖譜相符；誘導(dǎo)表達(dá)、分離純化后的重組蛋白經(jīng)過(guò)SDS-PAGE/Western blot鑒定，分別出現(xiàn)相應(yīng)的陽(yáng)性雜交條帶。表明這兩個(gè)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確，能表達(dá)出相應(yīng)蛋白hS100A2和hS100A6；Bradford法蛋白定量，計(jì)算出hS100A2和hS100A6的獲率分別為5mg/L菌液和3mg/L菌液。 2．在感染了AdS100A6的HCT116裂解液中，用SDS-PAGE/Western blot法檢測(cè)到hS

9、100A6的存在。表明AdS100A6攜帶的hS100A6基因能夠正常表達(dá)。 3．外源性S100A2和S100A6對(duì)細(xì)胞增殖的影響hS100A2和hS100A6分別作用HCT116時(shí)，hS100A2的重組蛋白組于第4天始出現(xiàn)細(xì)胞增殖抑制，與GST組的差異有顯著性(P<0.05)：hS100A6重組蛋白組于第5天出現(xiàn)增殖抑制(P<0.05)，AdS100A6組于第2天起，細(xì)胞數(shù)相對(duì)減少，與對(duì)照AdGFP組的差異有顯著性(P<0.0

10、5)。即hS100A6的重組蛋白和AdS100A6兩種作用方式均顯示出對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的抑制作用。 4．外源性S100A2和S100A6對(duì)細(xì)胞周期的影響：hS100A2和hS100A6分別作用HCT116后72h：hS100A2蛋白組的G0-G1期和S期的細(xì)胞分別是GST組的121％和58％，差異均具有顯著性(P<0.05)；hS100A6蛋白組的G0-G1期和S期的細(xì)胞分別是GST組的118％和67％，差異均具有顯著性(

11、P<0.05)；AdS100A6組的G1-G1期和S期的細(xì)胞分別是AdGFP組的134％(P<0.05)和59％(P>0.05)，S期呈降低的趨勢(shì)。 5．外源性S100A2和S100A6對(duì)HCT116凋亡的影響：hS100A2和hS100A6重組蛋白作用HCT116細(xì)胞48h時(shí)，凋亡率分別是對(duì)照組的2-3倍和2.0倍，差異顯著(P<0.05)；AdS100A6組的凋亡率是對(duì)照組的1.13倍，呈增加趨勢(shì)。提示hS100A2和hS1

12、00A6有促進(jìn)HCT116細(xì)胞凋亡的作用；S100A6以重組蛋白直接作用與基因轉(zhuǎn)入的方式對(duì)細(xì)胞凋亡的作用一致。 6．外源性S100A2和S100A6對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響：hS100A2重組蛋白分別作用HCT116和MG63細(xì)胞60h后，穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)分別較各自對(duì)照組減少75％和83％，差異均具有顯著性(P<0.01)。提示hS100A2對(duì)HCT116和MG63細(xì)胞有較強(qiáng)的遷移抑制作用。 hS100A6重組蛋白分別作用HC

13、T116和MG63細(xì)胞60h后，其穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)分別較各自對(duì)照組減少14％和 33％；AdS100A6組(48h)分別較各自對(duì)照組減少56％和37％，差異均有顯著性(P<0.01)。提示hS100A6能明顯抑制HCT116和MG63細(xì)胞的遷移，其重組蛋白直接作用與基因轉(zhuǎn)入的方式對(duì)細(xì)胞遷移能力的作用一致。 7．兩種重組蛋白作用MG63后，免疫熒光染色，Leica ConfocalSoftware計(jì)算各組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度：hS10

14、0A2組、hS100A6組分別是對(duì)照組的1.5和1.6倍，差異有顯著性(P<0.05)；激光共聚焦顯微鏡與透射光鏡下觀察：GST組的β-catenin主要位于胞漿中和核膜上，核內(nèi)β-catenin集中呈現(xiàn)1～2個(gè)亮點(diǎn)，似聚集在核仁部位；細(xì)胞核膜完整，核仁1～2個(gè)；兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)β-catenin的變化相似：胞漿β-catenin熒光著色增強(qiáng)，核內(nèi)β-catenin也明顯增加，呈現(xiàn)3～4個(gè)亮點(diǎn)，似位于核仁；但是，原來(lái)位于核膜上的β-cat

15、enin明顯減少甚至消失，并且細(xì)胞核膜欠完整，多數(shù)細(xì)胞內(nèi)的核仁為3～4個(gè)。 結(jié)論： 1．S100A2和S100A6能一定程度地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和人骨肉瘤細(xì)胞株MG63的增殖、改變其細(xì)胞周期分布(G0-G1期細(xì)胞增加，S期細(xì)胞減少)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡；其中，對(duì)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的作用可能參與了S100A2和S100A6對(duì)細(xì)胞增殖的抑制。 2．S100A2和S100A6能較明顯地抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT11

16、6和人骨肉瘤細(xì)胞株MG63的運(yùn)動(dòng)遷移能力，其中S100A2的作用更強(qiáng)。 3．S100A2和S100A6能增加骨肉瘤細(xì)胞株MG63細(xì)胞內(nèi)β-catenin的總含量，并改變其分布，最終表現(xiàn)為胞漿和胞核內(nèi)β-catenin表達(dá)增加，核膜上的表達(dá)明顯減少，胞核中的表達(dá)似聚集在核仁。 4．外源性S100A6以重組蛋白直接作用的方式與以基因轉(zhuǎn)入的方式均有同樣活性。提示S100A6是又一個(gè)能夠在細(xì)胞外發(fā)揮作用的S100家族成員；如用于

17、臨床目的，兩種作用方式均適用。 本課題通過(guò)MTT法或臺(tái)盼蘭/細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell小室探討了S100A2和S100A6作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和人骨肉瘤細(xì)胞株MG63后細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期、凋亡和遷移能力的變化，并用激光共聚焦技術(shù)探討了細(xì)胞內(nèi)β-catenin的變化，發(fā)現(xiàn)S100A2和S100A6能夠一定程度地抑制HCT116和MG63的增殖、阻滯細(xì)胞周期和促進(jìn)凋亡，后二者可能是其抑制細(xì)胞增殖的部分