γδT細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株的殺傷作用及分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言:
　　 骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤之一,目前采用手術(shù)、新輔助化療等綜合治療方案后,仍有30％～40％的骨肉瘤患者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,免疫治療是繼手術(shù)、化療之后,治療骨肉瘤的手段之一。在目前研究的免疫治療方法中,CD8+CTL細(xì)胞及經(jīng)典CD3-NK細(xì)胞,如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞,細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞等治療骨肉瘤的效果較差,因而在較長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi),免疫過繼治療的基礎(chǔ)及臨床研究處于相對(duì)停滯狀態(tài),而γδ T細(xì)胞作為新的具有特異性抗腫瘤活

2、性的免疫細(xì)胞,在抗腫瘤方面的潛在作用逐漸為人們所重視。
　　 以往認(rèn)為γδT細(xì)胞為一類不成熟的T細(xì)胞,其功能可能與壞死組織的清除有關(guān)。但越來越多的研究表明,γδ T細(xì)胞具有與CTL及NK細(xì)胞相似的殺傷腫瘤細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞的功能,因而在免疫監(jiān)視功能中發(fā)揮了極為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞對(duì)多發(fā)性骨髓瘤、黑色素瘤具有明顯的抗腫瘤作用;γδ T細(xì)胞在體內(nèi)的增殖后,能夠大量浸潤(rùn)至轉(zhuǎn)移性腎臟腫瘤中,滅殺和清除腫瘤細(xì)胞。更為有意義的是,

3、研究證明在人體外增殖后的γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系具有一定的抑制作用。但迄今為止,γδT細(xì)胞在體內(nèi)外如何殺滅骨肉瘤細(xì)胞及其具體的作用機(jī)制未見報(bào)道。
　　 目的:
　　 探討骨肉瘤患者與正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞中γδ T細(xì)胞比例的差異以及γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用及其可能的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 通過密度梯度離心法從10例骨肉瘤患者、5例骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者和10例正常人外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞后

4、,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδ T細(xì)胞所占的比例。外周血中分離出的單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)唑來膦酸刺激后,用含白介素-2培養(yǎng)基培養(yǎng)14天,再次用流式細(xì)胞儀測(cè)定γδT細(xì)胞的比例。
　　 按一定效靶比將γδ T細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞(MG63、U2OS、SAOS)體外混合培養(yǎng)4小時(shí)后,用乳酸脫氫酶釋放法檢測(cè)γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用。并用抗人。NKG2D抗體和抗人TCR-γδ-PE抗體阻斷γδ T細(xì)胞相關(guān)通路后,再次測(cè)定γδT細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞

5、的殺傷作用。最后用ELISA法檢測(cè)γδ T細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞(按效靶比1:20)混合培養(yǎng)8、12、24、48、72后上清液中IFN-γ和TNF-α的含量。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS15.0軟件完成,計(jì)量資料數(shù)據(jù)表示方式以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD),組間計(jì)量資料采用非獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義。
　　 結(jié)果：
　　 骨肉瘤患者組和骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞中γδT細(xì)胞的比例顯

6、著低于正常組。外周血中分離出單個(gè)核細(xì)胞在體外經(jīng)唑來膦酸刺激后,用含白介素-2的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)14天,γδ T細(xì)胞的比例能達(dá)到95％以上,且各組之間γδT細(xì)胞的比例無明顯差異。
　　 γδ T細(xì)胞對(duì)不同骨肉瘤細(xì)胞系都有明顯的殺傷作用,在體外骨肉瘤患者的γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用與正常人無明顯差異。用抗人NKG2D和抗人TCR-γδ-PE抗體分別阻斷γδ T細(xì)胞的相關(guān)途徑后,發(fā)現(xiàn)γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用減弱-γδ

7、T細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞(按效靶比1:20)混合培養(yǎng)24小時(shí)后,測(cè)得上清液中IFN-γ的含量明顯增加,而TNF-α則增加不明顯。
　　 結(jié)論：
　　 骨肉瘤患者組及骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者組外周血單個(gè)核細(xì)胞中γδ T細(xì)胞的比例明顯低于正常組,可能與在骨肉瘤患者體內(nèi)γδ T細(xì)胞的增殖功能受到抑制相關(guān);在體外γδ T細(xì)胞對(duì)骨肉瘤細(xì)胞有較強(qiáng)免疫殺傷作用,且骨肉瘤患者與正常人無明顯差異,其機(jī)制與γδT細(xì)胞表面NKG2D和TCR-γδ受體介導(dǎo)的