尼古丁對大鼠髕腱肌腱干細胞生物學特性影響的實驗研究.pdf

1、目的:探討體外尼古丁對大鼠髕腱肌腱干細胞（tendon-derived stem cells，TDSCs）的細胞活力，細胞早期凋亡以及肌腱相關基因表達的影響，揭示吸煙導致肌腱病變以及損傷肌腱延遲愈合潛在的細胞學發(fā)病機制。
　　方法:無菌條件下取8周齡SD大鼠的髕腱，Ⅰ型膠原酶消化分離獲得單個有核細胞，以最適密度（50個/cm2）進行接種，細胞呈克隆樣生長，獲得原代TDSCs?；A培養(yǎng)細胞至第3代，行成骨、成脂、成軟骨誘導分化鑒定其

2、干細胞的特性。然后將其分為兩組，實驗組用不同濃度的尼古丁培養(yǎng)基(10-7M，10-6M，10-5M，10-4M和10-2M)干預，對照組繼續(xù)采用基礎培養(yǎng)基(0M)培養(yǎng)。處理6h、24h、48h和72h后分別應用四唑鹽(MTT)比色法檢測尼古丁對TDSCs體外存活的影響，72h后應用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測尼古丁對TDSCs體外早期凋亡的影響，實時熒光定量PCR(Realtime PCR)檢測肌腱相關基因Collal和S

3、cx的表達。
　　結果:大鼠髕腱TDSCs體外培養(yǎng)呈克隆樣集落生長，首次換液后，細胞呈長梭形和多角形兩種形態(tài)，傳至第3代，細胞表現(xiàn)為成纖維細胞樣的紡錘形和星形的扁平細胞。TDSCs成骨誘導7天，茜素紅染色陽性;成脂誘導10天，油紅O染色陽性;成軟骨誘導14天，蘇木精-伊紅染色陽性。與對照組相比，實驗組不同濃度的尼古丁干預下，TDSCs的細胞活力呈下降趨勢，呈時間依賴性和濃度依賴性，濃度高于10-4M時作用顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(

4、p＜0.05)。流式細胞儀檢測TDSCs早期凋亡(AnnexinⅤ+/PI-)的數(shù)量隨著尼古丁濃度的增加而增加，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。同時，Realtime PCR檢測結果顯示:與對照組相比，實驗組中Collal和Scx的mRNA表達水平均降低，濃度高于10-5M時作用顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　結論:大鼠髕腱中可以分離培養(yǎng)出具有體外克隆形成以及多向分化潛能的肌腱干細胞。體外尼古丁可抑制大鼠髕腱T