肌肉衛(wèi)星細(xì)胞與肌腱干細(xì)胞生物學(xué)特性檢測及其在肌肉和肌腱損傷動物模型上的研究.pdf

1、運(yùn)動損傷主要包括肌肉組織部位的拉傷、扭傷和挫傷，以及肌腱和韌帶損傷。這些損傷不僅會影響身體健康而且阻礙日常生活與工作，當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中干細(xì)胞治療的出現(xiàn)使得治療相關(guān)疾病被寄予厚望。本研究旨在建立骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞與肌腱干細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)體系，并探索其細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)特性及其在肌肉損傷模型與肌腱損傷模型移植后體內(nèi)遷移情況，得到結(jié)論如下：
　　1.采用機(jī)械分離法與酶消化法，成功分離獲得肌肉衛(wèi)星細(xì)胞和肌腱干細(xì)胞，分離后的兩種細(xì)胞傳代培養(yǎng)

2、后增殖能力強(qiáng)，其中肌肉衛(wèi)星細(xì)胞傳至27代，肌腱干細(xì)胞傳至38代，此外經(jīng)凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞仍具有較高的活性。
　　2.通過RT-PCR、免疫熒光以及流式細(xì)胞儀對細(xì)胞相關(guān)特異性基因和表面標(biāo)記物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中Desmin、Pax7、c-Met、Myf5、MyoD，肌腱干細(xì)胞中collagen I，collagen III，CD44，Nucleostemin和Tenascin-C等特異性基因及表面抗原均呈陽性表達(dá)，表明所分

3、離的細(xì)胞分別具有肌肉衛(wèi)星細(xì)胞和肌腱干細(xì)胞的特性，此外對分離的兩種細(xì)胞進(jìn)行生長曲線和克隆形成能力、核型分析等生物學(xué)特性鑒定，表明細(xì)胞具有較強(qiáng)的增值能力并且無染色體突變，以此保證本實(shí)驗(yàn)獲取兩種干細(xì)胞可用于細(xì)胞庫的構(gòu)建及日后相關(guān)研究的使用。
　　3.為鑒定肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的多分化潛能特性，在體外將肌肉衛(wèi)星細(xì)胞分別向成肌細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、和成骨細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，而肌腱干細(xì)胞則向成脂細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)并對誘導(dǎo)結(jié)果進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明：肌

4、肉衛(wèi)星細(xì)胞在向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)7天后形態(tài)明顯發(fā)生變化，通過免疫組化對fast skeletal myosin抗體進(jìn)行染色結(jié)果呈陽性，RT-PCR檢測成肌相關(guān)基因MyoG與fast skeletal myosin均陽性表達(dá)；肌腱干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)軟骨球形態(tài)明顯，阿利新藍(lán)染色成陽性，RT-PCR相關(guān)基因Collagen II，SOX9和ACAN均表達(dá)；此外兩種細(xì)胞在向成脂和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)時均獲得成功，利用脂肪誘導(dǎo)液對肌肉衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，2

5、1天后油紅O染色可見到紅色脂滴，RT-PCR檢測到脂肪細(xì)胞特異性分子標(biāo)記LPL和PPAR-γ陽性表達(dá)；肌肉衛(wèi)星細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)液中誘導(dǎo)4周后進(jìn)行茜素紅染色呈陽性，RT-PCR檢測到成骨細(xì)胞特異性分子標(biāo)記Collagen I，OPN，RunX2和ALP陽性表達(dá)；以上研究表明肌肉衛(wèi)星細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過程中具有多分化潛能特性。
　　4．分別采用心臟毒素（Cytotoxin，CTX）和膠原酶構(gòu)建小鼠肌肉損傷模型與肌腱損傷模型，H&E（Hem

6、atoxylin-Eosin Staining，)染色顯示肌肉和肌腱組織正常結(jié)構(gòu)均被破壞，血清檢測發(fā)現(xiàn)CK均明顯超出正常范圍表明建模成功。對肌肉衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行CM-Dil細(xì)胞示蹤劑標(biāo)記，將標(biāo)記的細(xì)胞直接注射到小鼠肌肉損傷位點(diǎn)，熒光顯微鏡下可見組織中分布標(biāo)記的細(xì)胞，血清檢測顯示干細(xì)胞移植組CK值與損傷組和生理鹽水組相比有所降低，研究結(jié)果表明，對兩種模型進(jìn)行干細(xì)胞移植后可在三周內(nèi)穩(wěn)定的遷移到相應(yīng)組織中對損傷可能具有一定的作用。
　　綜上