在體肝癌HepG2細胞IER5基因輻射效應(yīng)及其啟動子區(qū)域的研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌（簡稱肝癌）位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第6位，新發(fā)肝癌病例中55％發(fā)生于中國，其年死亡率占我國各種癌癥死亡率的第2位，是我國最常見的消化道腫瘤之一。常用的肝癌非手術(shù)治療方法有：肝動脈栓塞化療、瘤內(nèi)無水酒精注射、射頻消融等，療效均不理想。放療是惡性腫瘤治療的三大手段之一，隨著三維適形放療和調(diào)強放療技術(shù)的發(fā)展，放療在肝癌治療中的地位被再次提出，近來大量臨床研究證實三維適形放療能顯著提高肝癌患者的中位生存期和生活質(zhì)量。目前，可以肯定的

2、講原發(fā)性肝癌屬于放療敏感腫瘤，放療已成為肝癌治療的有力武器。
　　 輻射敏感性是影響腫瘤放療效果的重要因素之一。為了增加輻射敏感性、提高腫瘤放療療效，人們試圖從基因?qū)佣鴮ふ覍椛涿舾械幕?。如果該基因在輻射之后出現(xiàn)表達變化，且這種表達變化能夠促進腫瘤細胞凋亡或抑制腫瘤細胞生長，那么該基因?qū)δ[瘤放療就很有意義，由此制定的放療方案就有可能很好地提高腫瘤的放療效果?；诖宋覀儾捎没蛐酒夹g(shù)篩選出輻射可誘導(dǎo)表達的基因，研究發(fā)現(xiàn)包括IE

3、R5基因（Immediate Early Response5）等30個基因在輻射后出現(xiàn)了mRNA表達上調(diào)。IER5基因?qū)儆谠缙诼磻?yīng)基因家族，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)IER5基因存在于一些腫瘤與正常組織中，可能與細胞周期和細胞凋亡有關(guān)。經(jīng)檢索國內(nèi)外文獻獲悉，目前人們對IER5基因研究不是很多，尚缺乏有關(guān)輻射對在體HepG2細胞IER5基因表達影響的研究報道，對于IER5基因表達調(diào)控機制的研究尚為空白?；诖吮菊n題選擇mRNA、蛋白表達、細

4、胞凋亡等實驗參數(shù)，對輻射誘導(dǎo)接種人肝癌HepG2細胞的裸鼠腫瘤組織IER5基因及蛋白表達的影響及輻射誘導(dǎo)該基因表達的啟動子區(qū)域進行了探索。
　　 目的：
　　 本課題選擇在體HepG2腫瘤細胞作為研究對象，采用Real-time PCR、Western blot、TUNEL染色等實驗方法研究IER5基因的輻射效應(yīng)；采用雙熒光素酶報告基因技術(shù)初步研究IER-5基因輻射應(yīng)答的啟動子區(qū)域。
　　 方法：
　　

5、1將離體培養(yǎng)的人肝癌HepG2細胞接種在BALB/c-nu裸鼠皮下，待腫瘤塊生長至約1.0cm×1.0cm時，讓裸鼠接受γ射線照射，輻射劑量分別為2Gy和4Gy。分別在輻射后4h和12h時按實驗要求取出瘤體，采用Real-time PCR實驗檢測輻射后接種人肝癌HepG2細胞的裸鼠腫瘤組織IER5基因mRNA表達的變化；并在輻射后12h采用Western blot和TUNEL染色等實驗方法，對腫瘤組織IER5蛋白表達水平及細胞凋亡情況進

6、行檢測。
　　 2應(yīng)用生物信息學(xué)分析方法對IER5基因上游8000bp的序列進行啟動子生物信息學(xué)分析，初步確定IER5基因啟動子的可能位置。在此基礎(chǔ)上，對IER5基因上游2000bp的序列構(gòu)建一系列缺失體，重組報告基因質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染離體培養(yǎng)的HepG2細胞，通過雙熒光素酶報告基因檢測方法檢測輻射前后不同缺失體片段所對應(yīng)的活性，確定與輻射誘導(dǎo)IER5基因表達有關(guān)的啟動子區(qū)域。
　　 結(jié)果：
　　 1.輻射對在體He

7、pG2細胞IER5基因mRNA表達的影響：采用Real-time PCR方法檢測mRNA水平。結(jié)果顯示：輻射后4h在體HepG2細胞IER5基因mRNA表達增加，4Gy輻射比2Gy輻射更能夠顯著的上調(diào)IER5基因mRNA的表達，2Gy和4Gy輻射組與對照組（0Gy組）相比mRNA分別升高了1.344倍與11.542倍；但是在輻射后12hIER5基因mRNA表達明顯下降，2Gy和4Gy輻射組IER5基因mRNA水平均低于對照組，且4Gy輻

8、射組比2Gy輻射組IER5基因mRNA的水平更低，分別為對照組的0.327倍與0.349倍。
　　 2.輻射對在體HepG2細胞IER5蛋白表達的影響：采用Western blot方法檢測蛋白表達水平。結(jié)果顯示：隨著輻射劑量的增加IER5蛋白表達明顯增加，4Gy輻射組hepG2細胞IER5蛋白表達水平明顯高于2Gy輻射組。
　　 3.輻射對在體HepG2細胞凋亡的影響：采用TUNEL染色法檢測細胞凋亡。結(jié)果顯示：隨著輻射

9、劑量的增加，在體HepG2細胞凋亡明顯增加（P<0.01）。此與IER5基因mRNA及蛋白的表達具有相似的變化趨勢，提示我們輻射可能通過上調(diào)IER5基因mRNA和蛋白的表達來增加肝癌細胞的凋亡。我們今后尚需對此進行更深入的研究。
　　 4.輻射誘導(dǎo)HepG2細胞IER5基因表達的啟動子區(qū)域：采用雙熒光素酶報告基因技術(shù)分析和鑒定啟動子活性。結(jié)果表明：IER5基因的啟動子區(qū)域在-408bp～-238bp范圍內(nèi)；在該范圍內(nèi)可能存在的調(diào)

10、控元件有四個，分別為：TGGCGC、GGCCGT、GCGCACA、CGCGG。經(jīng)過對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用2Gy劑量輻射各個缺失體，輻射后IER5-3活性增高，輻射組與對照組之間有顯著性差異（P=0.01），說明輻射能夠上調(diào)IER5基因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 結(jié)論：
　　 輻射可上調(diào)在體肝癌HepG2細胞IER5基因mRNA及蛋白的表達，4Gy輻射比2Gy輻射能夠更顯著的上調(diào)IER5基因mRNA及蛋白的表達，并且

11、隨著輻射劑量的增加，腫瘤細胞的凋亡明顯增加，提示輻射可能通過上調(diào)IER5基因的表達來增加肝癌細胞的凋亡，預(yù)示著IER5基因可能為輻射敏感基因，增加該基因的表達可能會增加肝癌對放療的敏感性，為進一步研究IER5基因的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。輻射誘導(dǎo)IER5基因表達的啟動子區(qū)域位于-408bp～-238bp范圍內(nèi)，可能存在的TGGCGC、GGCCGT、GCGCACA、CGCGG四個調(diào)控元件，為進一步研究IER5基因輻射誘導(dǎo)表達的調(diào)控機制奠定了