基于MAPK信號通路的葉黃素抗肝癌HepG2細胞增殖效應研究.pdf

1、背景與目的:原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是常見的消化道惡性腫瘤之一，其中90％是肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。隨著慢性肝炎、肝硬化發(fā)生率的升高，肝癌的發(fā)病率也在不斷的上升，我國是世界上肝癌發(fā)病率和死亡率最高的國家之一，發(fā)病人數(shù)約占全球的55％，死亡率占惡性腫瘤的第二位。肝癌的發(fā)生和發(fā)展是一個多因素，多步驟，多基因相互作用演變的結果，且發(fā)病隱匿，發(fā)病迅速，患者生存

2、周期短。目前肝癌的主要治療方法有手術切除，化療和放療等綜合治療，大部分肝癌患者確診時已是晚期，不適合手術切除，即使手術切除也易復發(fā)，放療和化療會給人體造成一定的毒副作用和產(chǎn)生化療耐藥性。因此，尋找一種高效低毒的天然植物藥物對肝癌的治療具有重要的臨床意義。
　　 葉黃素(Lutein)主要存在于蔬菜，水果等膳食中的一種含氧類胡蘿卜素，在抗氧化，預防白內(nèi)障，黃斑變性，延緩動脈硬化，抗腫瘤等方面有重要的作用，本實驗室前期研究已證明一定

3、濃度的葉黃素對食管癌，胃癌及乳腺癌細胞有顯著的增殖抑制作用。本實驗旨在研究葉黃素對人肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用并初步探討其分子機制。
　　 方法:本論文采用SRB法繪制人肝癌HepG2細胞8d的生長曲線;SRB法檢測不同濃度的葉黃素對HepG2細胞的增殖抑制作用;倒置顯微鏡下觀察葉黃素對HepG2細胞形態(tài)學的影響;流式細胞儀檢測藥物對HepG2細胞周期分布的影響;Hoechst33342/PI熒光染色法和流式細胞儀Anne

4、xin V-FITC/PI雙染法分別定性和定量檢測葉黃素對HepG2細胞凋亡的影響;Western blot檢測葉黃素處理HepG2細胞24h后，細胞內(nèi)ERK1/2和p38蛋白磷酸化的表達情況;RT-PCR檢測細胞內(nèi)AP-1mRNA、p53 mRNA、caspase-3mRNA的表達情況;SP免疫細胞化學法檢測葉黃素處理HepG2細胞后Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白的表達變化。
　　 結果:SRB檢測結果顯示，葉黃素

5、能顯著抑制HepG2細胞增殖，且有時間和劑量依賴性(P＜0.01)，40mg/L的葉黃素作用HepG2細胞24、48、72h后的抑制率分別為8.76％、11.73％、26.15％，160mg/L的葉黃素作用HepG2細胞24、48、72h后的抑制率分別上升為36.44％、63.47％、74.84％;流式細胞儀檢測細胞周期結果顯示，葉黃素將HepG2細胞周期阻滯于G0/G1期;Hoechst33342/PI雙染法檢測細胞凋亡情況，對照組顯

6、示低藍光和低紅光，隨著藥物濃度的逐漸增加，顯示高藍光和高紅光即凋亡細胞數(shù)目逐漸增加，定性地說明葉黃素能夠誘導HepG2細胞凋亡;流式細胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡結果顯示，對照組、80、160mg/L葉黃素組早期細胞凋亡的比率分別為0.12％、33.59％、21.11％，晚期細胞凋亡的比率分別為0.37％、22.50％、47.19％，定量地說明了葉黃素能誘導HepG2細胞凋亡;Western blot檢測結果

7、表明，葉黃素作用HepG2細胞24h后，ERK1/2蛋白的磷酸化水平下調(diào)，p38蛋白的磷酸化水平上調(diào)，且有濃度依賴性;RT-PCR檢測結果顯示，葉黃素作用HepG2細胞24h后，細胞內(nèi)AP-1mRNA的表達下調(diào)、p53 mRNA和caspase-3 mRNA的表達均上調(diào)，且有濃度依賴性，說明葉黃素可影響AP-1、p53、caspase-3基因的轉錄表達;免疫細胞化學法結果表明，Bcl-2/Bax蛋白的比值下調(diào)，caspase-3蛋白上調(diào)