基于MAPK信號(hào)通路的葉黃素抗肝癌HepG2細(xì)胞增殖效應(yīng)研究.pdf

1、背景與目的:原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，其中90％是肝細(xì)胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。隨著慢性肝炎、肝硬化發(fā)生率的升高，肝癌的發(fā)病率也在不斷的上升，我國(guó)是世界上肝癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家之一，發(fā)病人數(shù)約占全球的55％，死亡率占惡性腫瘤的第二位。肝癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素，多步驟，多基因相互作用演變的結(jié)果，且發(fā)病隱匿，發(fā)病迅速，患者生存

2、周期短。目前肝癌的主要治療方法有手術(shù)切除，化療和放療等綜合治療，大部分肝癌患者確診時(shí)已是晚期，不適合手術(shù)切除，即使手術(shù)切除也易復(fù)發(fā)，放療和化療會(huì)給人體造成一定的毒副作用和產(chǎn)生化療耐藥性。因此，尋找一種高效低毒的天然植物藥物對(duì)肝癌的治療具有重要的臨床意義。
　　 葉黃素(Lutein)主要存在于蔬菜，水果等膳食中的一種含氧類(lèi)胡蘿卜素，在抗氧化，預(yù)防白內(nèi)障，黃斑變性，延緩動(dòng)脈硬化，抗腫瘤等方面有重要的作用，本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證明一定

3、濃度的葉黃素對(duì)食管癌，胃癌及乳腺癌細(xì)胞有顯著的增殖抑制作用。本實(shí)驗(yàn)旨在研究葉黃素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用并初步探討其分子機(jī)制。
　　 方法:本論文采用SRB法繪制人肝癌HepG2細(xì)胞8d的生長(zhǎng)曲線(xiàn);SRB法檢測(cè)不同濃度的葉黃素對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用;倒置顯微鏡下觀察葉黃素對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)藥物對(duì)HepG2細(xì)胞周期分布的影響;Hoechst33342/PI熒光染色法和流式細(xì)胞儀Anne

4、xin V-FITC/PI雙染法分別定性和定量檢測(cè)葉黃素對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響;Western blot檢測(cè)葉黃素處理HepG2細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)ERK1/2和p38蛋白磷酸化的表達(dá)情況;RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)AP-1mRNA、p53 mRNA、caspase-3mRNA的表達(dá)情況;SP免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)葉黃素處理HepG2細(xì)胞后Bax、Bcl-2、caspase-3蛋白的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:SRB檢測(cè)結(jié)果顯示，葉黃素

5、能顯著抑制HepG2細(xì)胞增殖，且有時(shí)間和劑量依賴(lài)性(P＜0.01)，40mg/L的葉黃素作用HepG2細(xì)胞24、48、72h后的抑制率分別為8.76％、11.73％、26.15％，160mg/L的葉黃素作用HepG2細(xì)胞24、48、72h后的抑制率分別上升為36.44％、63.47％、74.84％;流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，葉黃素將HepG2細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期;Hoechst33342/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，對(duì)照組顯

6、示低藍(lán)光和低紅光，隨著藥物濃度的逐漸增加，顯示高藍(lán)光和高紅光即凋亡細(xì)胞數(shù)目逐漸增加，定性地說(shuō)明葉黃素能夠誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡;流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，對(duì)照組、80、160mg/L葉黃素組早期細(xì)胞凋亡的比率分別為0.12％、33.59％、21.11％，晚期細(xì)胞凋亡的比率分別為0.37％、22.50％、47.19％，定量地說(shuō)明了葉黃素能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡;Western blot檢測(cè)結(jié)果

7、表明，葉黃素作用HepG2細(xì)胞24h后，ERK1/2蛋白的磷酸化水平下調(diào)，p38蛋白的磷酸化水平上調(diào)，且有濃度依賴(lài)性;RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，葉黃素作用HepG2細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)AP-1mRNA的表達(dá)下調(diào)、p53 mRNA和caspase-3 mRNA的表達(dá)均上調(diào)，且有濃度依賴(lài)性，說(shuō)明葉黃素可影響AP-1、p53、caspase-3基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá);免疫細(xì)胞化學(xué)法結(jié)果表明，Bcl-2/Bax蛋白的比值下調(diào)，caspase-3蛋白上調(diào)