Rap1GAP對(duì)急性髓系白血病細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及作用機(jī)理的研究.pdf

1、目的和意義：
　　Rap1GAP屬于GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins, GAPs）家族，在Rap1這種小G蛋白GTP-GDP循環(huán)中起到重要作用。鳥(niǎo)苷酸交換蛋白（Guanine nucleotide exchange factors, GEPs）使Rap1由結(jié)合GDP的非活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為結(jié)合GTP的活性狀態(tài)，而Rap1GTP的內(nèi)在水解酶活性很低，需要GAPs加速GTP的水解，使活化的下游信號(hào)及時(shí)終

2、止。Rap1(Ras-proximate1)是Ras家族中的一員，通過(guò)MEK/ERK途徑影響細(xì)胞的增殖和分化；并調(diào)節(jié)integrins介導(dǎo)的細(xì)胞粘附和遷移，許多研究表明Rap1和腫瘤的關(guān)系密切，其上游調(diào)節(jié)分子也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)在胰腺癌、甲狀腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、黑色素瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Rap1GAP在這些腫瘤中表達(dá)下調(diào)，并且和腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移相關(guān)，Rap1GAP被認(rèn)為有可能是一潛在的抑癌基因。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)Rap1GA

3、P可能在骨髓增生異常綜合征（Myelodysplastic syndromes, MDS）發(fā)病機(jī)制中起作用。本試驗(yàn)擬通過(guò)構(gòu)建Rap1GAP慢病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染急性髓系白血病細(xì)胞株和動(dòng)物體內(nèi)模型來(lái)研究Rap1GAP對(duì)白血病細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，探討Rap1GAP在急性髓系白血?。ˋcute myeloid leukemia, AML）發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　方法：
　　第一部分：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)AML患者、非惡性腫瘤血液病患者

4、骨髓單個(gè)核細(xì)胞（Bone marrow mononuclear cells, BMNCs）以及AML細(xì)胞株（NB4、HL-60、SHI-1和U937）Rap1GAP mRNA表達(dá)水平，Western Blot檢測(cè)Rap1GAP蛋白表達(dá)水平；用含有BamHI酶切位點(diǎn)的上下游引物將Rap1GAP cDNA克隆至含有黃綠色熒光蛋白（Flavovirens fluorescent protein, YFP）的慢病毒表達(dá)載體pRRL-Venus，

5、磷酸鈣共沉淀法在293T細(xì)胞中進(jìn)行四質(zhì)粒系統(tǒng)病毒包裝，收集病毒顆粒轉(zhuǎn)染HL-60和NB4細(xì)胞，流式分選YFP陽(yáng)性細(xì)胞，有限稀釋法篩選出高表達(dá)Rap1GAP單克隆陽(yáng)性細(xì)胞株（H1、H2和N1、N2）；MTT法和體外集落培養(yǎng)檢測(cè)Rap1GAP對(duì)細(xì)胞增殖能力影響；ATRA和TPA誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化，ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化，24h、48h和72h進(jìn)行NBT還原試驗(yàn)和流式檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD11b，觀察Rap1GAP對(duì)細(xì)胞分化能力影響；A

6、s2O3誘導(dǎo)HL-60和NB4細(xì)胞凋亡24h，熒光顯微鏡觀察Rap1GAP對(duì)細(xì)胞凋亡能力影響；體外跨膜實(shí)驗(yàn)和明膠酶譜檢測(cè)Rap1GAP對(duì)細(xì)胞體外侵襲力影響。
　　第二部分：對(duì)4周齡的 BALB/c裸鼠進(jìn)行切脾、環(huán)磷酰胺腹腔注射及全身亞致死劑量輻照等預(yù)處理后隨機(jī)分空白對(duì)照組（n=5）和實(shí)驗(yàn)組（HL-60組、空載體MOCK組、R1組、R2組，每組n=8）。空白對(duì)照組經(jīng)尾靜脈注射0.2ml IMDM，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)尾靜脈接種1.2×107含不

7、同細(xì)胞的IMDM液0.2ml，后在層流柜中無(wú)菌飼養(yǎng)觀察至接種后60天。于裸鼠瀕死前或死亡后即行解剖，留取骨髓涂片，瑞氏染色觀察有無(wú)異常的白血病細(xì)胞；各臟器常規(guī)病理切片，觀察異常白血病細(xì)胞在各臟器中的浸潤(rùn)情況；RT-PCR檢測(cè)裸鼠各臟器中人白血病細(xì)胞Rap1GAP和MMP-9基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　第一部分：①在BMNCs中，AML患者Rap1GAP的mRNA表達(dá)水平低于非惡性腫瘤血液病患者（P<.05）。Rap1GAP

8、在AML細(xì)胞株（NB4、HL-60、SHI-1和U937）中轉(zhuǎn)錄和蛋白水平呈較低表達(dá)。②成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pRRL-Venus-Rap1GAP，包裝出高滴度病毒顆粒，流式檢測(cè)轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞效率為80%-90%。RT-PCR和Western Blot鑒定轉(zhuǎn)染Rap1GAP cDNA的單克隆細(xì)胞株HL-60（H1、H2）和NB4（N1、N2）均有外源性 Rap1GAP基因的整合和表達(dá)。單克隆細(xì)胞株 H1、H2和 N1、N2的Rap1GAP

9、mRNA表達(dá)水平各增加16.2、17.3倍和17.5、19.3倍，Rap1GAP蛋白表達(dá)水平亦顯著增高，Rap1-GTP蛋白顯著降低。③細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和體外集落培養(yǎng)亦證實(shí)Rap1GAP不影響白血病細(xì)胞株HL-60和NB4細(xì)胞增殖能力，Western Blot未檢測(cè)到ERK和p-ERK在Rap1GAP高表達(dá)細(xì)胞和空載體對(duì)照細(xì)胞之間的差異。④ATRA誘導(dǎo)HL-60分化過(guò)程中，H1和H2單克隆細(xì)胞組CD11b表達(dá)高于空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組， CD11

10、b表達(dá)為對(duì)照組1.4到2.1倍，24h時(shí)CD11b表達(dá)差異最為顯著。NBT還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果和流式檢測(cè)CD11b表達(dá)相符。TPA誘導(dǎo)HL-60分化48h和72h，H1和H2組表面CD11b顯著高于對(duì)照組，而24h兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ATRA誘導(dǎo)NB4細(xì)胞分化24h、48h，N1、N2組CD11b表達(dá)顯著增加為對(duì)照組1.2到2.0倍，而72h兩組之間區(qū)別不明顯。NBT結(jié)果和CD11b表達(dá)變化相似。⑤As2O3處理HL-60和NB4細(xì)胞24h，

11、Rap1GAP組即可觀察到明顯的凋亡細(xì)胞，而對(duì)照組細(xì)胞凋亡不明顯。⑥Rap1GAP高表達(dá)單克隆細(xì)胞株H1和H2的侵襲率顯著高于對(duì)照組HL-60細(xì)胞侵襲率（P<.001）。H1和H2分泌更多的MMP-9，而MMP-2在兩者之間差別不明顯。H1和H2的MMP-9轉(zhuǎn)錄水平增加，約為對(duì)照組細(xì)胞的12倍左右。
　　第二部分：空白對(duì)照組裸鼠注射后1－2周進(jìn)食減少、體重下降、消瘦，2周后逐漸恢復(fù)正常，生存期大于60天以上無(wú)死亡。HL-60組和M

12、OCK組裸鼠尾靜脈注射細(xì)胞后，亦出現(xiàn)1－2周進(jìn)食減少、體重下降、消瘦，2周后漸漸恢復(fù)，但6周左右再次出現(xiàn)進(jìn)食減少，消瘦，逐漸衰竭死亡。HL-60組平均存活時(shí)間為(44.25±2.12)d， MOCK組平均存活時(shí)間為(43.62±2.32)d。R1和R2組裸鼠發(fā)病時(shí)間較HL-60組提前，注射細(xì)胞后4－5周即再次出現(xiàn)進(jìn)食減少，體重下降，消瘦，衰竭死亡，3只裸鼠出現(xiàn)雙下肢癱瘓。R1組平均存活時(shí)間(32.00±1.85)d、R2組平均存活時(shí)間(

13、33.37±2.50)d。HL-60組和MOCK組裸鼠生存期無(wú)差別，R1組和R2組裸鼠較HL-60組生存期縮短（P<.05）。R1組和 R2組裸鼠共有3只裸鼠出現(xiàn)腦膜組織浸潤(rùn)，腦膜組織擴(kuò)增出Rap1GAP和MMP-9基因，部分裸鼠骨髓涂片中檢測(cè)到人白血病細(xì)胞，而其他臟器白血病細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯。HL-60組和MOCK組裸鼠各臟器白血病細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，未擴(kuò)增出Rap1GAP和MMP-9基因。
　　結(jié)論：
　　（1）Rap1GAP在

14、AML患者BNMCs中和急性髓系白血病細(xì)胞株（HL-60、NB4、SHI-1和U937）中均低表達(dá)。
　　（2）外源性上調(diào)Rap1GAP不影響HL-60和NB4細(xì)胞增殖能力。
　?。?）外源性上調(diào)Rap1GAP促進(jìn)HL-60和NB4細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力。
　?。?）外源性上調(diào)Rap1GAP降低HL-60和NB4細(xì)胞抗凋亡能力。
　?。?）外源性上調(diào)Rap1GAP增加HL-60體外和小鼠動(dòng)物模型體內(nèi)侵襲能力。
　

15、　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)于非惡性腫瘤血液病患者 Rap1GAP在 AML患者BMNCs中低表達(dá)，利用慢病毒表達(dá)載體上調(diào)白血病細(xì)胞株HL-60和NB4中Rap1GAP水平（17-19倍），我們發(fā)現(xiàn)Rap1GAP不影響HL-60和NB4細(xì)胞增殖能力，而促進(jìn)了ARTA誘導(dǎo)的HL-60和NB4細(xì)胞分化及TPA誘導(dǎo)的HL-60分化，而且上調(diào)Rap1GAP降低了白血病細(xì)胞株HL-60和NB4的抗As2O3誘導(dǎo)凋亡能力。而體外跨膜實(shí)驗(yàn)和白血病動(dòng)物模