Vγ9Vδ2T細胞對人急性髓系白血病細胞的殺傷作用及機理研究.pdf

1、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是成人急性白血病(acuteleukemia，AL)最常見的類型。盡管隨著化療方案的改善，AML完全緩解率(complete remission，CR)可達70％左右，仍有約20％的AML患者不能達到CR，屬于難治性病例，5年無病生存率極低。而即使初治CR患者大部分也會出現(xiàn)復發(fā)，一旦復發(fā)，預后差。耐藥以及白血病干細胞(leukemia stem cell，LSC)的存

2、在是AML難治及復發(fā)的根本原因。目前難治復發(fā)AML的治療仍比較困難，目前難治復發(fā)AML的治療仍比較困難，尚缺乏理想治療方案。
　　Vγ9Vδ2T細胞是近年來倍受關注的T細胞亞群之一，已證實其具有廣泛的特異性抗腫瘤作用。Vγ9Vδ2T細胞殺傷腫瘤不具MHC限制性，容易在體內(nèi)或體外進行大量擴增，且已在多種晚期實體瘤的臨床試驗中初步顯示出較好的安全性與療效?；谏鲜龌A，我們推測Vγ9Vδ2T細胞治療可能為難治復發(fā)AML的治療開辟新的方

3、向。
　　基于以上目的，我們擬解決以下三個科學問題:一、明確Vγ9Vδ2T細胞是否可以在體內(nèi)外殺傷AML細胞，尤其是難治耐藥細胞;二、明確Vγ9Vδ2T細胞識別及殺傷AML細胞以及難治耐藥細胞的機制;三、探索聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑優(yōu)化對Vγ9Vδ2T細胞體外誘導擴增的合理方案。
　　本研究通過以下三部分研究內(nèi)容闡明上述科學問題:
　　第一部分、Vγ9Vδ2T細胞對人急性髓系白血病細胞的殺傷作用研究
　　我們首先以A

4、ML亞型細胞株Kasumi-1、K562、NB4及HL-60為代表，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細胞對AML細胞的殺傷作用呈效靶比（efficacy to target ratio，E/T）依賴性及時間依賴性增強趨勢;Vγ9Vδ2T細胞對不同類型AML細胞的殺傷敏感性存在較大差異:對Kasumi-1細胞株殺傷作用最強，對K562及NB4細胞株殺傷作用中等，對HL-60細胞株殺傷作用極弱;與細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokinesinduced

5、killer cells，CIK)為對照，發(fā)現(xiàn)兩者對Kasumi-1、K562及NB4細胞的殺傷率無顯著統(tǒng)計學差異;
　　為研究Vγ9Vδ2T細胞對難治耐藥AML細胞的殺傷作用，我們以P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)高表達的蒽環(huán)類耐藥細胞株K562/AO2、HL-60/ADR及維甲酸受體（retinoic acid receptor，RAR）突變的維甲酸耐藥細胞株NB4/R1為代表，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細胞對其殺傷

6、率與其來源的親本株以及耐藥性無明顯相關;進一步收集了11例臨床難治耐藥AML病人的骨髓標本，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細胞對其骨髓原始細胞以及CD34+LSC也具有一定的體外殺傷作用，然而在E/T＜200∶1時，實際殺傷作用并不顯著;以正常骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells，BMMC)及正常成纖維細胞為對照，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細胞均無顯著殺傷作用;
　　為研究Vγ9Vδ2T細胞對難治耐藥AML細胞的

7、體內(nèi)殺傷作用，我們以K562/AO2耐藥細胞株為代表，構建了NOD/SCID小鼠人源化耐藥AML模型，發(fā)現(xiàn)唑來膦酸和IL-2聯(lián)合Vγ9Vδ2T細胞治療組與對照組及單用唑來膦酸和IL-2治療組比較，體重無明顯減輕，腫瘤負荷顯著降低，生存時間延長。
　　本部分實驗結(jié)果表明，Vγ9Vδ2T細胞可在體內(nèi)外水平殺傷AML細胞，包括難治耐藥細胞。Vγ9Vδ2T細胞對耐藥細胞的殺傷率與來源的親本株以及耐藥性無明顯相關。
　　第二部分、Vγ

8、9Vδ2T細胞識別及殺傷人急性髓系白血病細胞的機制研究
　　我們首先以Vγ9Vδ2T細胞殺傷作用最強的Kasumi-1細胞株為研究對象，通過高內(nèi)涵細胞分析系統(tǒng)觀察Vγ9Vδ2T細胞殺傷AML細胞過程的動態(tài)行為，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細胞與Kasumi-1共同孵育1h后，Vγ9Vδ2T細胞形態(tài)即發(fā)生明顯變異，伸出偽足，在共同孵育2h后，Vγ9Vδ2T細胞上出現(xiàn)捕獲Kasumi-1細胞膜的熒光融合信號;流式細胞術分析驗證了Vγ9Vδ2T細

9、胞捕獲Kasumi-1細胞膜現(xiàn)象;共聚焦顯微鏡觀察到兩者共同孵育4h后，Kasumi-1細胞呈現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)。
　　為明確Vγ9Vδ2T細胞殺傷AML細胞的機制，我們將Vγ9Vδ2T細胞與Kasumi-1、K562、HL-60細胞株、耐藥株K562/AO2以及2例難治耐藥AML病人骨髓原始細胞共同孵育4h，發(fā)現(xiàn)表達CD107a的Vγ9Vδ2T細胞比例顯著增加，伴刀球霉素A（ConcanamycinA，CMA）阻斷CD107a表達

10、后，Vγ9Vδ2T細胞的殺傷率明顯減低;使用FasL阻斷型抗體阻斷Fas與FasL作用途徑后，Vγ9Vδ2T細胞對Kasumi-1及NB4細胞的殺傷率無明顯變化;將Vγ9Vδ2T細胞與Kasumi-1、NB4細胞株共同孵育8h后發(fā)現(xiàn)其培養(yǎng)液上清中分泌型TNF-α(secreted TNF-α，sTNF-α)的水平明顯增加，但使用TNF-α阻斷型抗體阻斷TNF-α與TNF-α受體作用途徑后，Vγ9Vδ2T細胞對Kasumi-1及NB4細胞

11、的殺傷率無明顯變化;將Vγ9Vδ2T細胞與K562細胞以及耐藥株K562/AO2共同孵育5～20分鐘即可有效引起細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)分子磷酸化，對Vγ9Vδ2T細胞殺傷作用極弱的HL-60細胞則無明顯的ERK磷酸化現(xiàn)象;使用PD98059阻斷ERK通路及使用LY294002阻斷ERK上游Akt通路后顯著減弱Vγ9Vδ2T細胞與K562及K562/AO

12、2共同孵育4h后CD107a的表達，對HL-60細胞無顯著作用。
　　為進一步了解Vγ9Vδ2T細胞識別AML細胞的機制，我們通過阿托伐他汀阻斷TCR配體異戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate，IPP)在Kasumi-1、K562、NB4細胞株及耐藥株K562/AO2中的合成，發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細胞對上述細胞4h殺傷作用明顯減低;通過流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細胞表面高表達NKG2D、CD11a、CD2

13、26三個殺傷相關受體分子;NKG2D的配體MICA/B、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-4，CD11a的配體ICAM-1、ICAM-2以及CD226的配體Nectin-2、PVR在上述不同AML細胞株及耐藥細胞株中表達水平各異，Kasumi-1細胞表達以上所有相關配體;上述配體的表達在耐藥株與其來源的親本敏感株之間也存在較大差異;通過線性回歸模型進行相關性分析發(fā)現(xiàn)其中ULBP-4及Nectin-2的表達水平與V9Vδ2T細胞對其殺

14、傷作用存在密切相關性;使用阻斷型抗體阻斷NKG2D后發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細胞對表達ULBP-4的Kasumi-1細胞株4h殺傷率顯著減低;對不/低表達ULBP-4的細胞株K562、NB4及耐藥株K562/AO2細胞株無明顯變化;阻斷CD226后發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細胞對表達Nectin-2的細胞株Kasumi-1、K562、NB4及耐藥株K562/AO2的4h殺傷率均顯著減低;阻斷CD11a后發(fā)現(xiàn)Vγ9Vδ2T細胞對表達ICAM-1/2的細

15、胞株Kasumi-1、K562、NB4及耐藥株K562/AO2的4h殺傷率大部分無顯著變化。
　　本部分實驗結(jié)果表明，Vγ9Vδ2T細胞殺傷AML細胞依賴細胞間直接接觸及細胞膜捕獲作用，通過激活ERK通路磷酸化，觸發(fā)穿孔素、顆粒酶作用途徑，使靶細胞在4h內(nèi)發(fā)生凋亡。TCR-IPP、NKG2D-ULBP-4及CD226-Nectin-2識別途徑可能參與了Vγ9Vδ2T細胞對AML細胞的殺傷機制。Vγ9Vδ2T細胞的殺傷作用與細胞類型

16、及耐藥性無關，與AML細胞表面配體ULBP-4及Nectin-2的表達水平有關。
　　第三部分、聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑優(yōu)化Vγ9Vδ2T細胞體外誘導擴增方案的合理性研究
　　我們首先檢測了臨床引起慢粒細胞凋亡IC50濃度及臨床血藥峰濃度的伊馬替尼、尼洛替尼、達沙替尼對Vγ9Vδ2T細胞體外誘導擴增效率的影響。發(fā)現(xiàn)只有達沙替尼IC50濃度的誘導不僅顯著增加了Vγ9Vδ2T細胞誘導擴增的數(shù)量，同時保持了理想的誘導比例。為明確三種T

17、KI對Vγ9Vδ2T細胞增殖活化的影響，我們檢測了Vγ9Vδ2T細胞表面增殖活化分子CD69、HLA-DR及CD25的表達水平，發(fā)現(xiàn)只有達沙替尼IC50濃度可增強Vγ9Vδ2T細胞增殖活化分子CD69、HLA-DR的表達，與之前增殖實驗的結(jié)果一致。CD25分子在各組均無顯著差異。我們還檢測了Vγ9Vδ2T細胞表面與活化誘導的細胞凋亡有關的分子Fas的表達，發(fā)現(xiàn)達沙替尼IC50組及達沙替尼峰濃度組顯著下調(diào)了Fas的表達水平。
　　由

18、于在以上三種TKI中發(fā)現(xiàn)只有達沙替尼在IC50即10nmol/L濃度時可顯著增加Vγ9Vδ2T細胞的體外誘導擴增效率，而在峰濃度即200nmol/L時反呈抑制作用，表明不同濃度的達沙替尼對Vγ9Vδ2T細胞的體外誘導擴增作用可能有明顯差異。為摸索達沙替尼誘導Vγ9Vδ2T細胞體外擴增的最佳方案，我們進一步用濃度梯度的達沙替尼進行Vγ9Vδ2T細胞體外誘導培養(yǎng)，對Vγ9Vδ2T細胞的增殖能力以及對AML細胞的殺傷功能進行系統(tǒng)研究。發(fā)現(xiàn)達沙

19、替尼在10 nmol/L濃度范圍內(nèi)可促進Vγ9Vδ2T細胞的體外誘導擴增的絕對數(shù)量，其中在2umol/L時擴增的數(shù)量達到頂峰，而在大于10nmol/L濃度時呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用;達沙替尼在10 nmol/L濃度范圍內(nèi)可維持理想的Vγ9Vδ2T細胞誘導比例，而在大于10 nmol/L濃度時呈現(xiàn)濃度依賴性的抑制作用;濃度梯度的達沙替尼誘導后Vγ9Vδ2T細胞的脫顆粒作用均較對照組增強，并且這種增強作用隨達沙替尼濃度的增加呈現(xiàn)逐漸降低復上

20、升的趨勢;達沙替尼對Vγ9Vδ2T細胞的脫顆粒增強作用可能與增強其CD27-效應型亞群的比例有關，且在較低劑量時主要以誘導CD27-CD45RA-亞群比例增加為主，在較高劑量時以誘導CD27-CD45RA+亞群比例增加為主。
　　本部分實驗結(jié)果表明，合適劑量范圍內(nèi)的達沙替尼可通過上調(diào)增殖活化分子表達增強Vγ9Vδ2T細胞體外誘導的效率，下調(diào)Fas表達保持誘導Vγ9Vδ2T細胞的活力，并通過增強其CD27-效應型亞群的比例增強Vγ9

21、Vδ2T細胞對AML細胞的脫顆粒作用，對優(yōu)化目前Vγ9Vδ2T細胞體外誘導培養(yǎng)方案具有合理性。
　　綜上，本研究證實了Vγ9Vδ2T細胞可殺傷AML難治耐藥細胞，系統(tǒng)揭示了Vγ9Vδ2T細胞識別及殺傷AML細胞的分子機制，進一步闡明聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑達沙替尼可優(yōu)化目前Vγ9Vδ2T細胞體外誘導培養(yǎng)的方案。本研究可為難治耐藥AML的治療開辟新的思路，為豐富Vγ9Vδ2T細胞抗腫瘤生物學行為的認識奠定實驗基礎，并為優(yōu)化目前Vγ9Vδ