VEGF對(duì)耐藥白血病細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、目的：1．觀察人慢性髓性白血病細(xì)胞系敏感株K562細(xì)胞和耐藥株K562/A02細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)基因及蛋白的表達(dá)情況；并構(gòu)建針對(duì)人VEGF的特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)干擾片段，通過脂質(zhì)體2000將VEGFshRNA導(dǎo)入白血病耐藥株K562/A02細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染24h、48h及72h后耐藥白血病細(xì)胞VEGF基因及蛋白表達(dá)的變化。2．觀察白血病細(xì)胞VEGF下調(diào)后，耐藥白血病細(xì)胞的生物學(xué)行為的變化，探討VEGFshRNA對(duì)

2、K562/A02細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制，并觀察PI3K/AKT和MAPK/ERK信號(hào)通路在此過程中的作用。 方法：1．采用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)K562細(xì)胞和耐藥株K562/A02細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)情況，Westernblotting法檢測(cè)兩株細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)差異；并采用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)的方法將針對(duì)人VEGF基因的三個(gè)特異性shRNA及隨機(jī)片段HK(VEGFshRNA1、VEGFshRNA2

3、、VEGFshRNA、HK)轉(zhuǎn)染入K562/A02細(xì)胞，采用RT-PCR和Westernblotting法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h及72h后的這四組細(xì)胞和K562/A02細(xì)胞VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)情況，選取對(duì)VEGF基因干擾效果佳的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以未轉(zhuǎn)染組(K562/A02)及轉(zhuǎn)染隨機(jī)片段組(HK)為對(duì)照組。 2．采用苔盼蘭拒染細(xì)胞直接計(jì)數(shù)法、四唑藍(lán)比色法(MTT)和細(xì)胞周期測(cè)定分析VEGFshRNA對(duì)K562/A

4、02細(xì)胞增殖的影響，AnnexinV檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后白血病細(xì)胞的凋亡情況，采用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后阿霉素對(duì)耐藥白血病細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)的變化，計(jì)算其增敏倍數(shù)，RT—PCR、流式細(xì)胞術(shù)和Westernblotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后白血病細(xì)胞耐藥相關(guān)基因(MDR1、MRP1、topoⅡ)及其蛋白的表達(dá)變化，采用胞內(nèi)羅丹明123(Rho123)潴留試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后白血病細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P—gp及MRP1的功能狀態(tài)，采用免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染

5、前后白血病細(xì)胞MAPK/ERK和PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化水平。 結(jié)果：1．與敏感株K562細(xì)胞比較，耐藥株K562/A02細(xì)胞VEGF基因的表達(dá)水平更高，兩組細(xì)胞VEGFmRNA與β—actin的灰度比值分別為0.518±0.055、0.814±0.073(t=6.845，p＜0.001)，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；并且免疫印跡法顯示類似的結(jié)果，K562/A02細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)水平顯著高于K562細(xì)胞。通過脂質(zhì)體介導(dǎo)

6、的方法將隨機(jī)片段HK和VEGFshRNA轉(zhuǎn)染入K562/A02細(xì)胞，共獲5組細(xì)胞，依次為K562/A02、K562/A02-HK、K562/A02-VEGFshRNA1、K562/A02-VEGFshRNA2和K562/A02-VEGFshRNA3；轉(zhuǎn)染24h、48h及72h后，RT—PCR結(jié)果顯示：不同時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)片段HK組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)均無(wú)差異，而轉(zhuǎn)染VEGFshRNA的各組細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)水平均低于H

7、K組，其中轉(zhuǎn)染VEGFshRNA2和VEGFshRNA3組與HK組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)，并且轉(zhuǎn)染不同時(shí)間VEGFshRNA3對(duì)VEGF的抑制率分別為(29.6±1.1)％、(45.9±1.6)％和(43.2±1.5)％；Westernblotting結(jié)果也顯示：轉(zhuǎn)染24h、48h及72h后，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組VEGF的蛋白條帶強(qiáng)度均比未轉(zhuǎn)染組和HK組減弱，其中以轉(zhuǎn)染VEGFshRNA3組最明顯，與PCR結(jié)果基本一致。說明VEGFs

8、hRNA的導(dǎo)入有效地抑制了目的基因的轉(zhuǎn)錄與蛋白的表達(dá)，并且以VEGFshRNA3的干擾效果最明顯。 2．細(xì)胞生長(zhǎng)曲線提示，與對(duì)照組比較，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)分析顯示陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組G1期細(xì)胞增多，G2期與S期細(xì)胞顯著減少(p＜0.05)，提示VEGF的表達(dá)可能參與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)。在小劑量As2O3作用下，未轉(zhuǎn)染組無(wú)明顯凋亡，HK組與陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞均出現(xiàn)凋亡，AnnexinV檢測(cè)結(jié)果顯示：陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的早期凋亡數(shù)量高

9、于HK組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，5組細(xì)胞的凋亡細(xì)胞率依次為(1.52±0.56)％、(9.14±0.98)％、(11.09±1.47)％(t=2.206，p=0.07)、(19.89±1.63)％(t=11.29，p＜0.001)和(32.30±2.16)％(t=19.527，p＜0.001)，其中轉(zhuǎn)染VEGFshRNA2和VEGFshRNA3組與HK組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明VEGFshRNA的導(dǎo)入可能部分地抑制了藥物對(duì)耐藥白血病細(xì)胞的誘導(dǎo)

10、凋亡作用。MTT結(jié)果顯示陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組的阿霉素IC50值明顯低于HK組和未轉(zhuǎn)染組，各組細(xì)胞的IC50值分別為19.23±1.633、18.66±1.632、17.67±1.425(t=0.982，p=0.364)、16.11±1.184(t=2.553，p=0.043)及11.46±1.061(t=7.394，p＜0.001)，其中轉(zhuǎn)染VEGFshRNA2和VEGFshRNA3組與HK組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT—PCR結(jié)果顯示：與HK組及

11、未轉(zhuǎn)染組比較，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組耐藥相關(guān)基因MDR1、MRP1、topoⅡmRNA的表達(dá)水平均出現(xiàn)不同程度的下調(diào)，并且均以轉(zhuǎn)染VEGFshRNA3組下調(diào)最顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Westernblotting結(jié)果顯示：陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組MRP1蛋白和topoⅡ蛋白表達(dá)水平均低于HK組和未轉(zhuǎn)染組，且均以轉(zhuǎn)染VEGFshRNA3組下調(diào)最顯著；流式細(xì)胞儀顯示：5組細(xì)胞P—gp的平均熒光強(qiáng)度分別為68.44±2.08、67.59±1.82、61.20±1.47

12、(t=5.463，p=0.002)、58.03±1.63(t=7.823，p＜0.001)、40.72±1.22(t=24.51，p＜0.001)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組P—gp的表達(dá)量均明顯低于HK組和未轉(zhuǎn)染組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；說明VEGF可能調(diào)節(jié)耐藥相關(guān)基因MDR1、MRP1、topoⅡ的轉(zhuǎn)錄及翻譯。胞內(nèi)Rho123潴留試驗(yàn)顯示：5組細(xì)胞羅丹明123的平均熒光強(qiáng)度分別為11.823±1.611、11.784±1.633、15.683±1.633

13、(t=3.377，p=0.015)、16.158±1.45(t=3.613，p=0.011)、699.294±73.485(t=18.707，p＜0.001)(n=4)，各陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組與HK組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明VEGFshRNA的導(dǎo)入可能抑制P—gp及MRP1的外排功能，從而增加細(xì)胞內(nèi)藥物的濃度；Westernblotting結(jié)果顯示陽(yáng)性轉(zhuǎn)染組P—ERK和P—AKT的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于HK組及未轉(zhuǎn)染組，顯示VEGFshRNA的導(dǎo)入

14、可以抑制ERK和AKT的磷酸化水平，從而影響其下游基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。 結(jié)論：耐藥株K562/A02細(xì)胞VEGF基因和蛋白的表達(dá)水平明顯高于其敏感株K562細(xì)胞，轉(zhuǎn)染VEGF特異性shRNA能下調(diào)K562/A02細(xì)胞VEGF基因與蛋白的表達(dá)，減慢細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，VEGFshRNA的導(dǎo)入使耐藥白血病細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性增加，某些耐藥相關(guān)基因如MDR1、MRP1、topoⅡ表達(dá)的下調(diào)，可以使PI3K/AKT和MAPK/ERK信