急性髓系白血病干細胞NOD-SCID小鼠白血病模型的建立.pdf

1、背景:
　　 急性髓系白血病（acute myeloblastic leukemia, AML）是一種起源于AML干細胞的以髓細胞失控性增殖為特征的危及生命的惡性克隆性疾病，AML的臨床進展和預(yù)后與侵襲細胞類型、遺傳學(xué)改變以及克隆的生物學(xué)特性緊密相關(guān)。盡管隨著化療方案的不斷改進，AML患者的治療效果已有明顯改善，但復(fù)發(fā)及大劑量化療的毒副作用仍是影響AML療效進一步提高的主要障礙。過去已有研究表明，化療是無法根除白血病干細胞，未被

2、清除的AML干細胞還能繼續(xù)維持疾病，最終導(dǎo)致患者復(fù)發(fā)[1]。從白血病干細胞特性研究AML發(fā)病機制，開發(fā)新的治療方案，越來越引起研究者的重視。
　　 目前認為AML是起源于一群數(shù)量稀少的AML干細胞(LSCs)，又叫AML起始細胞，它們具有幼稚的表型和自我增殖、更新的能力。在多數(shù)情況下，AML干細胞和正常造血干細胞(HSC)一樣，不僅有一些共同的表面標(biāo)記，如CD34+和CD38-;而且AML干細胞通常處于靜止期，因此對常規(guī)化療藥物

3、十分不敏感，且容易對多種化療藥物產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象[2]。因此AML干細胞已成為了AML治療的關(guān)鍵靶點。
　　 目前認為AML除了急性早幼粒細胞白血病之外，其他各亞型的AML干細胞的細胞表面抗原的類型大多都是一樣的，免疫表型主要為CD34+CD38-。以往對AML干細胞的研究主要是通過從AML患者骨髓中分選CD34+CD38-細胞作為AML干祖細胞或AML起始細胞。但這種方法獲得的AML干細胞數(shù)量非常有限，往往不能滿足研究的需要。

4、KG1a細胞系來源于男性AML—M0耐藥的細胞株，其高表達多藥耐藥基因和P糖蛋白，對常規(guī)白血病化療藥物高度耐藥[3]。近年來國內(nèi)外學(xué)者已有不少文獻報道從KG1a細胞中分選CD34+CD38-細胞作為AML干細胞進行相應(yīng)的研究。
　　 研究針對AML干細胞的靶向治療藥物前提是建立AML干細胞的動物模型。AML干細胞的特點之一是可以植入非肥胖型糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠體內(nèi)。NOD/SCID小鼠是SCID小鼠與

5、糖尿病小鼠的雜交產(chǎn)物，它缺乏功能性NK細胞及循環(huán)補體，抗原提呈細胞分化及功能不良，并且不發(fā)生自身免疫性糖尿病，有利于腫瘤細胞以植入，且較少發(fā)生排斥反應(yīng)及移植物抗宿主病（GVHD），是比較理想的造血系統(tǒng)惡性腫瘤動物模型。本研究以分選CD34+CD38-KG1a細胞及雌性NOD/SCID小鼠為研究對象，建立AML干細胞NOD/SCID小鼠動物模型，為AML干細胞體內(nèi)實驗研究奠定可靠基礎(chǔ)。
　　 研究目的:
　　 探討用NOD

6、/SCID小鼠和經(jīng)流式細胞儀分選出的KG1a中CD34+CD38-的AML干細胞亞群建立急性髓系白血病模型的有效方法，研究AML干細胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)形成AML的生物學(xué)特征，為靶向治療AML干細胞的藥物篩選奠定體內(nèi)試驗基礎(chǔ)。
　　 研究方法:
　　 1、應(yīng)用流式細胞儀分選KG1a細胞中具有AML干細胞特性的CD34+CD38-亞群，并進行AML干細胞特性的鑒定;
　　 2、將NOD/SCID小鼠隨機分為

7、實驗組和對照組，兩組小鼠經(jīng)全身X線照射2Gy，24h后通過尾靜脈注射把CD34+CD38KG1a細胞（用臺盼藍拒染法，細胞活性95％，2×106個/只，液體總量0.2 ml）移植到實驗組小鼠，對照組小鼠通過尾靜脈注射等體積PBS作為正常對照;
　　 3、觀察小鼠的一般情況，比較兩組小鼠移植后體重，應(yīng)用細胞化學(xué)染色動態(tài)觀察小鼠骨髓及外周血細胞形態(tài)學(xué)改變;
　　 4、移植5周后處死小鼠，采用組織病理檢查，檢測小鼠肝臟、脾臟、

8、肺臟、腎臟以及骨髓等的白血病特征;
　　 5、應(yīng)用骨髓染色體檢查分析接受人源KG1a細胞移植后的雌性發(fā)病小鼠染色體核型;
　　 6、采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，多種處理因素作用比較采用析因方差分析;兩組間均數(shù)的比較使用獨立樣本t檢驗方法;多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析方法進行統(tǒng)計，在方差分析顯著的情況下使用LSD方法（方差齊性）進行多重比較;若方差不齊則采用近似F檢驗（如Welch方法）代替方差分析后采用D

9、unnett T3方法進行多重比較;計量資料用x±s表示，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，雙側(cè)檢驗。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、KG1a細胞經(jīng)抗人CD34-FITC、CD38-PE雙抗標(biāo)記后，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示KG1a細胞含有CD34+CD38-細胞，CD34+CD38-亞群細胞占KG1a細胞比例為（55.48±4.95）％，而經(jīng)流式分選后的CD34+CD38-細胞純度達到（93.16±2.7）％。
　　 2、接種

10、CD34+CD38-KG1a細胞4周時，實驗組小鼠出現(xiàn)萎靡少動、精神不振、食欲下降、彎腰駝背、皮毛起皺、行動遲緩、喜相擁成團、體重不增或下降。接種5周后，實驗組小鼠體質(zhì)量均較對照組小鼠顯著下降(P＜0.05)，外周血及骨髓涂片易見白血病細胞。
　　 3、移植后5周，實驗組小鼠腹腔內(nèi)可見局部實體瘤，肝、脾較對照組小鼠增大，肉眼觀可見彌漫性腫瘤結(jié)節(jié)或呈顆粒狀外觀;組織切片發(fā)現(xiàn)白血病細胞在肝、脾、肺、腎及骨髓中浸潤，以骨髓和脾臟受侵犯

11、最為顯著，應(yīng)用免疫組化可檢測到脾臟、肝臟中的白血病細胞表達人CD45和CD34特異性標(biāo)記抗原。
　　 4、小鼠骨髓細胞中可見人類染色體核型，且發(fā)現(xiàn)其含有7q-，8p+，12p+，i(11q)等染色體異常，與接種的分選后的KG1a細胞的異常染色體核型相一致，并出現(xiàn)Y染色體。
　　 結(jié)論:
　　 成功建立AML干細胞NOD/SCID小鼠白血病模型，可用于進行針對AML干細胞的新藥療效實驗，評價藥物的療效及相關(guān)毒副反應(yīng)