Polι與PolιS5在移行細(xì)胞癌組織的表達(dá)及對(duì)UVC導(dǎo)致的DNA損傷復(fù)制的功能對(duì)比研究.pdf

1、研究背景與目的： 腫瘤分子遺傳學(xué)研究普遍認(rèn)為腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因改變多步驟的過(guò)程。目前腫瘤的病因?qū)W主要包括：病毒、化學(xué)因素、物理因素、激素因素。膀胱癌在我國(guó)男性泌尿生殖系腫瘤中發(fā)生率第一，而且近年有發(fā)生率增加和年輕化趨勢(shì)。 本課題擬對(duì)PolιS5與Polι的功能進(jìn)行對(duì)比研究，同時(shí)探討Polι在膀胱腫瘤細(xì)胞株表達(dá)的意義，并進(jìn)一步檢測(cè)PolιS5與Polι在移行細(xì)胞癌組織是否高表達(dá)，與移行細(xì)胞癌組織的異質(zhì)性生物學(xué)行為是否相

2、關(guān)。本研究將對(duì)我們了解PolιS5的功能，進(jìn)一步理解膀胱腫瘤的發(fā)生及其高異質(zhì)性的分子機(jī)制，具有重要的理論意義。 方法： 1、PolιS5與Polι在膀胱腫瘤細(xì)胞株BIU87、T24的表達(dá)。培養(yǎng)膀胱腫瘤細(xì)胞株BIU87、T24，收集臨床膀胱正常粘膜組織作為對(duì)照。臨床標(biāo)本膀胱正常粘膜組織15例來(lái)自第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院泌尿外科研究所，正常膀胱粘膜組織取自距膀胱腫瘤2cm以上的正常粘膜，標(biāo)本切取后均立即放入液氮凍存，防止RNA降

3、解。采用Tripure提取組織和細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)PolιS5與PolιmRNA在膀胱腫瘤細(xì)胞株BIU87、T24和膀胱正常粘膜組織的表達(dá)。 2、pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5的轉(zhuǎn)化和鑒定。pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5由第三軍醫(yī)大學(xué)生化與分子生物學(xué)教研室楊勁副教授贈(zèng)送，利用氯化鈣法將三個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌，經(jīng)過(guò)進(jìn)

4、行質(zhì)粒小抽，初步鑒定后，進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果利用生物信息技術(shù)BLAT(www.genome.ucsc.edu)進(jìn)行鑒定。以證明pEGFP-C1-PolιS5的目的片段PolιS5比pEGFP-C1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外顯子，為我們進(jìn)一步對(duì)Polι與PolιS5的功能對(duì)比研究奠定基礎(chǔ)。 3、Polι與PolιS5對(duì)UVC導(dǎo)致的DNA損傷的功能對(duì)比研究。通過(guò)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞在受到紫外線UVC照射后P

5、olι及：PolιS5在細(xì)胞核分布的改變分析其功能差異。培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，將質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，36小時(shí)后，用紫外線UVC(15J/m2)照射使細(xì)胞DNA損傷，12小時(shí)后用激光共聚焦顯微鏡觀察在質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，細(xì)胞核綠色熒

6、光蛋白在紫外線照射后分布的改變。 4.PolιS5與Polι在臨床移行細(xì)胞癌組織標(biāo)本的表達(dá)。臨床標(biāo)本來(lái)自第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院泌尿外科研究所，膀胱正常粘膜組織15例，膀胱腫瘤組織28例，腎盂癌組織11例；移行細(xì)胞癌組織Ⅰ級(jí)13例，Ⅱ級(jí)16例，Ⅲ級(jí)10例。組織標(biāo)本取自2005年5月2006年9月在西南醫(yī)院行膀胱腫瘤切除術(shù)及腎盂癌根治手術(shù)的患者，經(jīng)過(guò)病理檢查證實(shí)，均為移行上皮細(xì)胞癌。在腫瘤原發(fā)灶上切取200mg左右組織作為癌組織標(biāo)本；

7、正常膀胱粘膜組織來(lái)自距膀胱腫瘤2cm以上的正常粘膜，作為對(duì)照。標(biāo)本切取后均立即放入液氮凍存，防止RNA降解。采用Tripure提取組織和細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)PolιS5與PolιmRNA在臨床移行細(xì)胞癌組織標(biāo)本的表達(dá)。 結(jié)果： 1、成功培養(yǎng)膀胱腫瘤細(xì)胞株BIU87、T24；通過(guò)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在BIU87和T24腫瘤細(xì)胞株有豐富的PolιmRNA表達(dá)，且較膀胱正常粘膜組織表達(dá)有非常顯著差異(P＜0.01)

8、；并發(fā)現(xiàn)PolιS5在膀胱腫瘤細(xì)胞株有表達(dá)，但在膀胱正常粘膜組織未檢測(cè)到PolιS5的表達(dá)；在BIU87和T24腫瘤細(xì)胞株，Polι的表達(dá)較PolιS5表達(dá)豐富，并有非常顯著差異(P＜0.01)。膀胱腫瘤細(xì)胞株BIU87及T24中，Polι的表達(dá)顯著增加，由于Poh，高水平的表達(dá)可能導(dǎo)致DNA跨損傷復(fù)制過(guò)程中基因的高突變，因此Polι的高表達(dá)可能與膀胱腫瘤的發(fā)生相關(guān)；在膀胱腫瘤細(xì)胞株BIU87及T24中，發(fā)現(xiàn)PolιS5的表達(dá)，在文獻(xiàn)中

9、尚未見(jiàn)報(bào)道；PolιS5在膀胱腫瘤細(xì)胞株表達(dá)的意義尚待研究。 2、成功將質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，并進(jìn)行質(zhì)粒小抽，初步鑒定后將質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果利用生物信息技術(shù)BLAT(www.genome.ucsc.edu)證明：pEGFP-C1-PolιS5的目的片段PolιS5比pEGFP-C1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外顯子，為我們進(jìn)一步

10、對(duì)Polι與PolιS5的功能對(duì)比研究奠定了基礎(chǔ)。 3、在質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞的細(xì)胞核均有綠色熒光，且很均勻，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率幾乎達(dá)100％。在紫外線UVC(15J/m2)照射三種細(xì)胞后，質(zhì)粒pEGFP-C1轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞核熒光仍然很均勻，pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-PolιS5轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞核均出現(xiàn)熒光聚集現(xiàn)象，同

11、時(shí)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pEGFP-C1-PoliotaS5(20％)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞核出現(xiàn)熒光聚集現(xiàn)象的細(xì)胞比例明顯高于質(zhì)粒pEGFP-C1-Polι(6％)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞核出現(xiàn)熒光聚集現(xiàn)象的細(xì)胞比例。說(shuō)明：PolιS5與Polι在紫外線UVC導(dǎo)致的DNA損傷的跨損傷復(fù)制過(guò)程中可能起著相似的作用，而且PolιS5可能比Polι更敏感，結(jié)合DNA更緊密，但更詳細(xì)的過(guò)程尚須進(jìn)一步研究；PolιS5可能對(duì)UVC損傷較補(bǔ)骨脂素、順鉑導(dǎo)致的DN

12、A損傷有一定的依賴性。 4、通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，PolιmRNA在膀胱正常粘膜組織、膀胱腫瘤組織及腎盂癌組織均有表達(dá)，Polι在膀胱腫瘤及腎盂癌組織的表達(dá)顯著高于膀胱正常粘膜組織的表達(dá)(P＜0.01)；Polι在Ⅰ級(jí)移行細(xì)胞癌組織和Ⅱ級(jí)移行細(xì)胞癌組織的表達(dá)顯著高于膀胱正常粘膜組織的表達(dá)(P＜0.05；P＜0.01)；在Ⅲ級(jí)移行細(xì)胞癌組織的表達(dá)顯著高于Ⅰ級(jí)移行細(xì)胞癌組織(P＜0.05)。但我們未檢測(cè)到PolιS5在膀胱正常粘膜、

13、膀胱腫瘤、腎盂癌組織的表達(dá)。結(jié)果表明：膀胱腫瘤組織和腎盂癌組織Polι的表達(dá)顯著增加，可能與膀胱腫瘤的發(fā)生有關(guān)；移行細(xì)胞癌組織Polι的表達(dá)顯著增加與膀胱腫瘤、腎盂癌的異質(zhì)性相關(guān)；在移行細(xì)胞癌組織未發(fā)現(xiàn)PolιS5的表達(dá)，但不能排除PolιS5在其它組織的豐富表達(dá)。 結(jié)論： 1、在膀胱腫瘤細(xì)胞株BIU87及T24中，發(fā)現(xiàn)Polι的剪接體PolιS5； 2、PolιS5與Polι在對(duì)紫外線UVC導(dǎo)致的DNA損傷后的