人源DNA聚合酶Polδ最小亞基p12及相關(guān)蛋白在DNA損傷和細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控分析.pdf

1、哺乳動物DNA聚合酶Polδ，是一個由四亞基組成的復(fù)合物，四個亞基分別是p125、p50、p68和p12。它不僅在DNA復(fù)制過程中有重要的作用，而且也參與DNA的修復(fù)和基因的重組。
　　細(xì)胞內(nèi)外各種因素可導(dǎo)致DNA嚴(yán)重的損傷，破壞基因組的完整性。為了應(yīng)對復(fù)制壓力或基因損傷試劑造成DNA損傷，細(xì)胞自身擁有一套防御機(jī)制-DNA損傷應(yīng)答(DDR)。這一機(jī)制通過募集和裝備一系列與修復(fù)相關(guān)的蛋白復(fù)合物來協(xié)調(diào)整個應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，包括DNA修復(fù)、

2、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的激活以及細(xì)胞的凋亡等。目前普遍認(rèn)為DDR是一個復(fù)雜的過程，它能夠使DNA進(jìn)行修復(fù)，固定損傷突變的位置或者通過細(xì)胞的死亡來消除損傷。就像Derks等提到的，傳感蛋白檢測到DNA損傷，并將一系列的相關(guān)因子招募到損傷點(diǎn)。例如修復(fù)因子等。相應(yīng)的，這些感受器擴(kuò)大對效應(yīng)器的損傷信號，如p53和微小RNA，它們能夠控制細(xì)胞多種通路的活性，如細(xì)胞周期的停滯和凋亡。傳感器和DDR信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)主要依賴于蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用以及蛋白質(zhì)翻譯后

3、的修飾。轉(zhuǎn)錄組學(xué)、全基因組RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究極大地?cái)U(kuò)展了我們對DDR的認(rèn)識。研究表明，有許多其它的蛋白是檢查點(diǎn)激酶的靶標(biāo)，在轉(zhuǎn)錄因子/微RNA的調(diào)控下，1000多個基因在DNA損傷處差異表達(dá)。因此，DDR的嚴(yán)格監(jiān)控是非常重要的。
　　當(dāng)DNA受到損傷，DNA聚合酶Polδ的p12亞基發(fā)生降解，Polδ4四聚體轉(zhuǎn)換為三聚體Polδ3。當(dāng)損傷無法修復(fù)時，細(xì)胞凋亡或衰老程序?qū)⒈患せ?，來去除損傷的細(xì)胞，避免突變和癌癥的發(fā)

4、生。細(xì)胞凋亡作為細(xì)胞一種基本的生命活動現(xiàn)象，不但在生物體內(nèi)去除衰老和異常的細(xì)胞中起著重要的作用，而且它在維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、促進(jìn)生物體的進(jìn)化中發(fā)揮重要的作用。
　　那么在DNA損傷中，有哪些相關(guān)蛋白參與其中呢？對應(yīng)p12的下調(diào)，響應(yīng)蛋白又是如何調(diào)控昵？在細(xì)胞凋亡過程中p12及相關(guān)蛋白又是如何變化的呢？因此，在本研究中，我們首先以人宮頸癌HeLa-S3細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，用三種不同DNA損傷處理試劑HU(hydroxyurea)、MMS(

5、methyl methanesulfonate)、和APH(Aphidicolin)處理細(xì)胞，通過Western Blot分析，驗(yàn)證前期所觀察到的DNA損傷后p12降解現(xiàn)象以及確定完全降解的時間。然后根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期二維電泳和質(zhì)譜分析的結(jié)果（見表Ⅰ），挑選出5個差異蛋白（包括2個上調(diào)蛋白和3個下調(diào)蛋白）在HeLa細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。進(jìn)一步以這三種DNA損傷處理試劑HU、MMS、和APH處理黑素瘤細(xì)胞，驗(yàn)證上述差異蛋白的變化在其它細(xì)胞中是否具

6、有普遍性。最后我們用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡試劑A23187處理HeLa細(xì)胞和黑素瘤細(xì)胞，觀察Polδ的四個亞基p125、p68、p50、p12以及上述5個差異蛋白在細(xì)胞凋亡過程中的變化情況以及這種現(xiàn)象是否具有普遍性。
　　初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)HeLa細(xì)胞經(jīng)HU、MMS、和APH DNA損傷試劑處理，DNA受到損傷，p12發(fā)生降解，這與先前的研究結(jié)果相符;用HU處理HeLa細(xì)胞，對應(yīng)p12的降解，我們觀察到HRF（組胺釋放因子）蛋白發(fā)生明顯上

7、調(diào)，并且HRF的上調(diào)與p12的降解密切相關(guān)，這種現(xiàn)象在黑素瘤細(xì)胞中也同樣存在，說明這種現(xiàn)象具有普遍性，而在MMS和APH處理的細(xì)胞中沒有觀察到這種現(xiàn)象，說明不同的損傷試劑造成DNA損傷的機(jī)制不同，可能引發(fā)不同的損傷應(yīng)答;用HU、MMS、和APH分別處理黑素瘤細(xì)胞，ALG（細(xì)胞凋亡基因）發(fā)生不同程度的上調(diào)現(xiàn)象，而在HeLa細(xì)胞中沒有觀察到這種現(xiàn)象，說明不同的細(xì)胞應(yīng)對DNA損傷的方式不同;用鈣離子載體A23187處理HeLa細(xì)胞，在細(xì)胞凋亡

8、晚期，p125、p68和p50逐漸降解，p12和ALG在不同時間段發(fā)生不同程度的上調(diào)，說明它們都參與鈣離子載體A23187引發(fā)的細(xì)胞凋亡過程，這種現(xiàn)象在黑素瘤細(xì)胞中也同樣存在，說明這種現(xiàn)象具有普遍性;用鈣離子載體A23187處理HeLa和黑素瘤細(xì)胞，我們觀察到只有在HeLa細(xì)胞中HRF發(fā)生上調(diào)，這說明不同細(xì)胞應(yīng)對細(xì)胞凋亡的機(jī)制不同。
　　本研究可以加深我們對細(xì)胞如何應(yīng)對DNA損傷的理解，對揭示人類癌癥的病因或由于基因的不穩(wěn)定導(dǎo)致的