dna的復(fù)制損傷與修復(fù)f

1、Replication and damage repair,第二章 DNA的復(fù)制、損傷和修復(fù),第一節(jié) DNA的復(fù)制(Replication, DNA biosynthesis),指DNA雙鏈在細(xì)胞分裂以前進(jìn)行的復(fù)制過程。,,哺乳動物的細(xì)胞周期,（一）半保留復(fù)制 DNA在復(fù)制時，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi

2、-conservative replication)。,意義：半保留復(fù)制說明DNA在代謝上的穩(wěn)定性。經(jīng)過許多代的復(fù)制，DNA鏈仍可保持完整，這在生物的遺傳上是十分重要的。,一、DNA 復(fù)制特征,DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。該實(shí)驗(yàn)首先將大腸桿菌在含15N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)約十五代，使其DNA中的堿基氮均轉(zhuǎn)變?yōu)?5N。將大腸桿菌移至只含14N的培養(yǎng)基中同步培養(yǎng)一代

3、、二代、三代。分別提取DNA，作CsCl密度梯度離心.,半保留復(fù)制證據(jù),（以原核生物 大腸桿菌為例）原料： dNTP，Mg++雙鏈DNA模板引物（primer），常是RNA，有游離的 3’OH。引物酶（primase，DnaG），用于合成復(fù)制所必需的RNA引物 解螺旋酶 ( helicase ) , DnaB, 由DnaA和DnaC協(xié)助在復(fù)制的起始點(diǎn)（Ori C）上解開雙螺旋。,,與復(fù)制有關(guān)的酶和因子,復(fù)制的起始點(diǎn)

4、與方向,親代DNA開鏈，復(fù)制起始點(diǎn)呈叉型移動,復(fù)制起始點(diǎn)（ori）：DNA復(fù)制要從DNA分子的特定部位開始，此部位稱復(fù)制起始點(diǎn)    原核：一個起始點(diǎn)，約245bp,特殊的重復(fù)序列     真核：多個起始點(diǎn),,ori,E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC跨度為245bp，包括兩個關(guān)鍵序列：13bp的序列和9bp序列,它是決定和控制E.coli染色體復(fù)制的唯一片

5、段。,13bp序列區(qū)，每一個順序都由GATC開始，富含A和T，有助于螺旋解開，控制復(fù)制何時開始。,9bp重復(fù)序列，重復(fù)出現(xiàn)4次，能與起始蛋白dnaA特異結(jié)合，當(dāng)dnaA蛋白（約20種）結(jié)合于ori的4個部位上時復(fù)制開始。 dnaA蛋白（一種專一的蛋白）和ori結(jié)合后，雙螺旋解開形成復(fù)制叉。故dnaA蛋白與啟動解鏈有關(guān),dnaA蛋白是起始的關(guān)鍵成分。,大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)成串排列的重復(fù)序列,基因組能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的功能單位稱為復(fù)制子

6、(replicon)，每個復(fù)制子都含有控制復(fù)制起始的起點(diǎn)(origin)，可能還有終止復(fù)制的終點(diǎn)(terminus)。每個起始點(diǎn)產(chǎn)生兩個移動方向相反的復(fù)制叉，復(fù)制完成時，復(fù)制叉相遇并匯合連接。習(xí)慣上把兩個相鄰起始點(diǎn)之間的距離定為一個復(fù)制子。,（二）復(fù)制子,,一個復(fù)制子只含有一個專一的復(fù)制起點(diǎn)和復(fù)制結(jié)束的終點(diǎn)。一個完整的復(fù)制子在一個細(xì)胞周期只復(fù)制一次(真核)。 原核生物染色體和質(zhì)粒都是獨(dú)立（只有單一個）復(fù)制子；真核細(xì)胞染色

7、體中有多個復(fù)制子組成。,DNA復(fù)制時，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個方向進(jìn)行復(fù)制. 但在低等生物中,也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）①. 原核細(xì)胞：染色體和質(zhì)粒 固定起點(diǎn) 雙向復(fù)制，②. 真核生物：染色體DNA，復(fù)制時多個起始點(diǎn)。,（三）復(fù)制方向,復(fù)制方向,DNA合成的方向單向、雙向？,1個起始點(diǎn),復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖(Caims實(shí)驗(yàn)),將3H-胸苷標(biāo)記大腸桿菌D

8、NA，經(jīng)過近兩代的時間，3H-胸苷摻入大腸桿菌DNA 。用溶菌酶把細(xì)胞壁消化掉，使完整的大腸桿菌染色體DNA釋放出來，放射自顯影，得到上圖。非復(fù)制部分（C）銀粒子密度較低，由一股放射性鏈和一股非放射性鏈構(gòu)成。已復(fù)制部分站整個染色體的三分之二，其中一條雙鏈（ B ）僅有一股鏈?zhǔn)菢?biāo)記的，另外一股雙鏈（ A ）的兩股鏈都是標(biāo)記的，銀粒子密度為前二者的兩倍。染色體全長約為1100微米。,,雙向復(fù)制,,復(fù)制子,真核生物兩個相鄰復(fù)制起始點(diǎn)之間的DN

9、A片段,,以起始點(diǎn)為中心，向兩個方向進(jìn)行復(fù)制,,多個起始點(diǎn),二、 DNA復(fù)制的酶學(xué),1. 模板：解開成單鏈的DNA母鏈,3. DNA聚合酶，DNA-pol,2. 底物dNTP ：dATP，dGTP，dCTP，dTTP,4. 引物（primer）：RNA引物,5. 其他酶和蛋白質(zhì)因子,解鏈相關(guān)酶類,1. 解旋酶(helicase),2. 拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase I、II）,3. 單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB),DNA解旋酶

10、(helicase)（解鏈酶） 功能：DNA的雙螺旋解鏈（解DNA雙鏈），解開一對堿基，需2分子ATP， 作用點(diǎn)：DNA上局部單鏈處，向雙鏈方向解鏈。 種類：E.coli有四種解螺旋酶，I、II、III和rep蛋白。 I、II、III中任一種沿模板5'-3 '方向移動，rep蛋白沿模板3 ' -5'方向移動。,,拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topo）,DNA正超螺旋與負(fù)超螺旋,,,負(fù)超螺旋,正超螺旋,DNA雙

11、螺旋,拓?fù)洚悩?gòu)酶,首先在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，它可使DNA的一條鏈發(fā)生斷裂和再連接，反應(yīng)無需供給能量。 另外，DNA復(fù)制時負(fù)超螺旋的消除，亦由拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ來完成，但它對正超螺旋無作用。,Ⅰ型拓?fù)洚悩?gòu)酶,,,由兩個A亞基和兩個B亞基組成，即A2B2。它能使DNA的兩條鏈同時發(fā)生斷裂和再連接，當(dāng)它引入負(fù)超螺旋以消除復(fù)制叉前進(jìn)帶來的扭曲張力時，需要由ATP提供能量。 兩種拓?fù)洚悩?gòu)酶在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和重組中均發(fā)揮重要作

12、用。,Ⅱ型拓?fù)洚悩?gòu)酶,,,拓?fù)洚悩?gòu)酶 I 抑制劑：喜樹堿類拓?fù)洚悩?gòu)酶 II 抑制劑：依托泊苷，多柔比星，阿霉素類等,單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）,作用：防止單鏈DNA重新形成雙鏈，防止單鏈DNA被核酸酶水解,,,,SSB,,,,DNA聚合酶（DNA-pol） 即依賴于DNA的DNA聚合酶（DDDP）,真核生物有多種： DNA-pol ?、?、?、?、?…,原核生物有3種： DNA-polⅠ、 Ⅱ

13、、 Ⅲ,DNA聚合酶功能,5´?3´聚合作用5´?3´外切酶3´?5´外切酶活性,大腸桿菌三種DNA聚合酶比較,,,,,,,DNA聚合酶Ⅱ,分子量每個細(xì)胞的分子統(tǒng)計數(shù)5´-3 ´聚合酶作用3´-5 ´核酸外切酶作用5´-3 ´核酸外切酶作用轉(zhuǎn)化率主要功能活性（nt/min）,DNA聚合酶Ⅰ,DNA

14、聚合酶Ⅲ（復(fù)合物）,109，000400+++1校讀,修復(fù)1000,120，00040++-0 .05,400，00010-20+++50復(fù)制100000,特 性,不清填補(bǔ)缺口50,引物酶(Primase)和引發(fā)體,催化RNA引物合成的酶叫引物酶，它是一種特殊的RNA聚合酶,DNA合成需在RNA引物的基礎(chǔ)上進(jìn)行,DnaA,,引發(fā)體（primosome）：包括解螺旋酶 、DnaC、引物酶及DNA復(fù)

15、制的起始區(qū)域,,,,,,,,小 結(jié),主要成員,主要作用,DnaA 識別復(fù)制起始位點(diǎn),解螺旋酶 解開DNA雙鏈,SSB 維持已解開單鏈DNA的穩(wěn)定,引物酶 合成RNA引物,TOPO 使打結(jié)、纏繞、正超螺旋的DNA松馳,DNA-pol Ⅲ DNA

16、復(fù)制,DNA-polⅠ 水解引物、填補(bǔ)空隙、修復(fù)作用,DNA連接酶 催化雙鏈DNA中單鏈缺口的連接,三、復(fù)制的化學(xué)反應(yīng),生成磷酸二酯鍵,,+ dN2TP,+PPi,DNA pol,3’——TAGAAGACCTATTGGCC——5’,5’——ATCTTCTGGATAACCGG——3’,第三節(jié) DNA生物合成過程,1.復(fù)制的起始,2.鏈的延長,3.復(fù)制的終止,一 復(fù)制的起始,(一) DNA解成單鏈,由特定

17、蛋白質(zhì)識別復(fù)制起始位點(diǎn)（ori），在解螺旋酶、TOPO酶及單鏈DNA結(jié)合蛋白的共同作用下，DNA解鏈，解旋，形成復(fù)制叉,?,倒Y,(二)引發(fā)體的生成,解旋酶解開雙鏈后引物酶進(jìn)入形成引發(fā)體,,,,,（三） RNA引物的合成,參與復(fù)制起始的蛋白因子,,名稱,功能,,DnaA蛋白 辨認(rèn)起始點(diǎn),解螺旋酶（DnaB，Rep） 解開DNA雙鏈,DnaC

18、 協(xié)助解螺旋酶,引物酶（DnaG） 催化RNA引物生成,SSB 穩(wěn)定解開的單鏈,拓?fù)洚悩?gòu)酶 理順DNA鏈,OriC E.coli復(fù)制起始點(diǎn),,領(lǐng)頭鏈的合成,引物合成后，由DNA polⅢ（在真核細(xì)胞為DNA聚合酶?和?)催化，按堿基配對原則，將dNTP逐一添加到引物3’ 末端，

19、形成磷酸二酯鍵，使新合成的鏈不斷延長,二 復(fù)制的延長,3’——AAGACCTATT——5’,,5’——TTCTGGATAA——3’,DNA Pol I, II and III,,延 長,,岡崎片斷,,,復(fù)制過程簡圖,半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuous replication),領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。,領(lǐng)頭鏈(leading strand),隨從鏈(lagging strand)

20、,隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接,三 復(fù)制的終止,原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。,第四節(jié)、真核生物DNA生物合成,（一）DNA的復(fù)制只發(fā)生在S期（二）多復(fù)制子（三）真核細(xì)胞含有5種DNA聚合酶（四）端粒復(fù)制 染色體兩端DNA子鏈上最后復(fù)制的RNA引物，去除后留下空隙。,需要引物 DNA聚合酶不能直接聚合游離的dNTP，必須由一段核酸片段提供3’OH末

21、端作為引物(primer) ，才能開始聚合子代DNA鏈。 RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個核苷酸，而在真核生物中約為10個核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對。雙向復(fù)制 DNA復(fù)制時，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。,,半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuous replication）,由于DN

22、A聚合酶只能以5’→3’方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須為3’→5’。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是不同的。定義：在DNA復(fù)制過程中，親代DNA分子中以3’→5’方向的母鏈作為模板指導(dǎo)新的鏈以5’→ 3’方向連續(xù)合成;另一股以5’→ 3’ 為方向的母鏈則指導(dǎo)新合成的鏈以 5’→ 3’方向合成1000—2000個核苷酸長度的許多不連續(xù)的片段（崗崎片段）。這種復(fù)制方式稱

23、之為半不連續(xù)復(fù)制。,,,PPP,,OH,+,,,DNA合成方向不可能是3′→5′的解釋,,,5’,5’,3’,3’,,,,,,,,,5’,5’,3’,3’,5’,5’,3’,3’,前導(dǎo)鏈,隨從鏈,,崗崎片段,半不連續(xù)復(fù)制,,,以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)?'→3'，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈(leading strand)。而以5'→3&#

24、39;方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5'→3'，這條鏈被稱為隨從鏈(lagging strand)。,前導(dǎo)鏈：在引物的3’端按5’→3’方向連續(xù)不斷地合成的DNA鏈。隨從鏈：在引物的3’端按5’→3’方向不連續(xù)合成的DNA鏈。岡崎片段：隨從鏈上不連續(xù)合成的DNA短片段（不包括引物）,由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時是逐步解開的，因此，隨從鏈的合成是一段一段的。DNA在復(fù)制時，由

25、隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazaki fragment)。 岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個核苷酸，而在真核生物中約為100個核苷酸。,DNA聚合酶（DNA polymerase）,聚合酶III ——主要的復(fù)制酶，兼有校讀、糾錯的功能 有從5’——3’ 延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性，有模板依賴性，其延伸的方式是依據(jù)堿基互補(bǔ)配對的原則，將原料dNTP與末

26、端核苷酸游離的3’ OH以3’,5’磷酸二酯鍵連接，同時釋出一個PPi 。DNA聚合酶延伸多核苷酸鏈的方向總是5’ 3’ 有從3’——5’ 外切酶的活性，以切除可能錯配的核苷酸,,聚合酶 I 用于切除引物RNA,并填補(bǔ)留下的空隙 有從5’——3’ 延伸多核苷酸鏈的聚合酶的活性； 有從3’——5’ 外切酶的活性，以切除可能錯配的核苷酸；

27、 有從5’——3’ 外切酶的活性，其作用是切除引物聚合酶II 活性弱,作用與聚合酶III相似 有從5’——3’延伸多核苷酸鏈的聚合酶活性； 有從3’——5’ 外切酶的活性,323個氨基酸,小片段,5? ? ??核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604個氨基酸,DNA聚合酶活性 ?? ? 5? 核酸外切酶活性,,,,N 端,C 端,DNA-p

28、ol Ⅰ,Klenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。,DNA連接酶（ligase）,將不連續(xù)的DNA片段以3’，5’磷酸二酯鍵連接起來，原核生物通過分解NAD為NMN和Pi提供能量，真核生物則消耗ATP,,復(fù)制的終止,由DNA聚合酶I完成切除引物，并且填補(bǔ)空隙，由DNA連接酶將DNA片段連接起來。,真核生物端粒的形成 端粒(telomere)是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨

29、大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復(fù)序列構(gòu)成可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。 線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進(jìn)行延長反應(yīng)。 端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對末端DNA鏈進(jìn)行延長。,1.端粒telemer：指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。 2.結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）由末端單鏈

30、DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成。（2）末端DNA序列是多次重復(fù)的富含G、C堿基的短序 列。,端粒（telomere） 染色體線性DNA分子末端 通常膨大成粒狀 共同的結(jié)構(gòu)特征: 富含TG 短重復(fù)序列 維持染色體穩(wěn)定端粒酶（telomerase） RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體 逆轉(zhuǎn)錄酶 延長末端DNA鏈進(jìn)行,3.功能：（1）維持染色體的穩(wěn)定性（2）維持D

31、NA復(fù)制的完整性 4.端粒酶：由RNA和蛋白質(zhì)組成（1）RNA發(fā)揮模板作用（2）蛋白質(zhì)發(fā)揮逆轉(zhuǎn)錄酶活性,端粒酶的催化延長作用,爬行模型,,DNA聚合酶復(fù)制子鏈,進(jìn)一步加工,第五節(jié)、DNA的幾種復(fù)制方式（1）、    直線雙向復(fù)制單點(diǎn)雙向，T7噬菌體多點(diǎn)雙向，真核染色體DNA（2）、θ型復(fù)制：環(huán)狀雙鏈DNA，對稱復(fù)制，單向或雙向（E .coli.）（3）、   

32、; 滾環(huán)復(fù)制：環(huán)狀單鏈DNA，Φx174（4）、    D環(huán)復(fù)制（取代環(huán)復(fù)制）：不對稱復(fù)制，線粒體、葉綠體DNA。兩條鏈的復(fù)制起點(diǎn)不在同一點(diǎn)上，一條鏈先復(fù)制，另一條鏈保持單鏈而被取代：當(dāng)一條鏈復(fù)制到一定程度時才暴露出另一條鏈的復(fù)制起點(diǎn)，另一條鏈才開始復(fù)制。,線性DNA的復(fù)制,成環(huán)或多連體復(fù)制：如T4,λ噬菌體 多連體復(fù)制：兩個5´ 有空缺的分子通過3 ´ 凸出的重復(fù)序列互

33、補(bǔ)，DNA pol I 從3 ´ 補(bǔ)齊這個空缺，連接酶連接裂縫，再用限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生3 ´ 凹端，pol I便可填補(bǔ)空缺產(chǎn)生新鏈。,末端二級結(jié)構(gòu)：發(fā)夾結(jié)構(gòu)或十字形交叉作為引物端粒復(fù)制蛋白質(zhì)介導(dǎo) 末端連接蛋白質(zhì)提供3 ´-OH，如Ф29，腺病毒3 ´端有-80KDa的特異性蛋白（TP)，以Ser的OH基團(tuán)形成磷酸二酯鍵，作為引物進(jìn)行鏈取代方式復(fù)制。,環(huán)狀DNA的復(fù)制,θ復(fù)制滾環(huán)復(fù)制

34、D-環(huán)復(fù)制,滾環(huán)復(fù)制和D環(huán)復(fù)制,滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication)：是某些低等生物的復(fù)制形式，如?X174和M13噬菌體等。,滾環(huán)復(fù)制的過程,,,D環(huán)復(fù)制(D-loop replication) ：是線粒體DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的復(fù)制形式。,第六節(jié) DNA的損傷一、DNA的損傷（突變） 由自發(fā)的或環(huán)境的因素引起DNA一級結(jié)構(gòu)的任何異常的改變稱為DN

35、A的損傷，也稱為突變（mutation）。常見的DNA的損傷包括堿基脫落、堿基修飾、交聯(lián)，鏈的斷裂，重組等。（一）引起突變的因素1．自發(fā)因素(1) 自發(fā)脫堿基：由于N-糖苷鍵的自發(fā)斷裂，引起嘌呤或嘧啶堿基的脫落。每日可達(dá)近萬個核苷酸殘基。(2) 自發(fā)脫氨基：胞嘧啶自發(fā)脫氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自發(fā)脫氨基可生成次黃嘌呤。每日可達(dá)幾十到幾百個核苷酸殘基。(3) 復(fù)制錯配：由于復(fù)制時堿基配對錯誤引起的損傷，發(fā)生頻率

36、較低。,2．物理因素 由紫外線、電離輻射、X射線等引起的DNA損傷。其中，X射線和電離輻射常常引起DNA鏈的斷裂，而紫外線常常引起嘧啶二聚體的形成，如TT，TC，CC等二聚體。這些嘧啶二聚體由于形成了共價鍵連接的環(huán)丁烷結(jié)構(gòu)，因而會引起復(fù)制障礙。,,3．化學(xué)因素(1) 脫氨劑：如亞硝酸與亞硝酸鹽，可加速C脫氨基生成U，A脫氨基生成I。(2) 烷基化劑：這是一類帶有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷

37、基，引起堿基或磷酸基的烷基化，甚至可引起鄰近堿基的交聯(lián)。(3) DNA加合劑：如苯并芘，在體內(nèi)代謝后生成四羥苯并芘，與嘌呤共價結(jié)合引起損傷。(4) 堿基類似物：如5-FU等，可摻入到DNA分子中引起損傷或突變。(5) 斷鏈劑：如過氧化物，含巰基化合物等，可引起DNA鏈的斷裂。,（二）DNA突變的類型 堿基的轉(zhuǎn)換,,二、DNA損傷的修復(fù) DNA損傷的修復(fù)方式可分為直接修復(fù)和取代修復(fù)兩大類。

38、,,（一）直接修復(fù)1．光復(fù)活（light repairing） 這是一種廣泛存在的修復(fù)作用。光復(fù)活能夠修復(fù)任何嘧啶二聚體的損傷。,其修復(fù)過程為： 光復(fù)活酶（photo-lyase)識別嘧啶二聚體并與之結(jié)合形成復(fù)合物→在300～600nm可見光照射下，酶獲得能量，將嘧啶二聚體的丁酰環(huán)打開，使之完全修復(fù)→光復(fù)活酶從DNA上解離。,2．轉(zhuǎn)甲基作用 在轉(zhuǎn)甲基酶的催化下，將DNA上的被修飾的甲基去除。

39、此時，轉(zhuǎn)甲基酶自身被甲基化而失活。3．直接連接 DNA斷裂形成的缺口，可以在DNA連接酶的催化下，直接進(jìn)行連接而封閉缺口。,（二）取代修復(fù)1．切除修復(fù)(excision repairing) 這也是一種廣泛存在的修復(fù)機(jī)制，可適用于多種DNA損傷的修復(fù)。該修復(fù)機(jī)制可以分別由兩種不同的酶來發(fā)動，一種是核酸內(nèi)切酶，另一種是DNA糖苷酶。 　　　　　 ⌒ 可修復(fù)TT，電離輻射，某些化學(xué)誘變劑造成的D

40、NA結(jié)構(gòu)的破壞 　參加的酶有：特異的核酸內(nèi)切酶；外切酶；聚合酶；連接酶。,,,2．重組修復(fù)(recombination repairing) 這是DNA的復(fù)制過程中所采用的一種有差錯的修復(fù)方式。(重組修復(fù)，復(fù)制后修復(fù) ),,3．SOS修復(fù) 由DNA損傷或抑制復(fù)制的處理所引起的一系列復(fù)雜的誘導(dǎo)效應(yīng)，稱為應(yīng)急反應(yīng)（SOS）。這是一種在DNA分子受到較大范圍損傷并且使復(fù)制受到抑制時出現(xiàn)的修

41、復(fù)機(jī)制，以SOS借喻細(xì)胞處于危急狀態(tài)。 　　DNA分子受到長片段高密度損傷，使DNA復(fù)制過程在損傷部位受到抑制。損傷誘導(dǎo)一種特異性較低的新的DNA聚合酶，以及重組酶等的產(chǎn)生。由這些特異性較低的酶繼續(xù)催化損傷部位DNA的復(fù)制，復(fù)制完成后，保留許多錯誤的堿基，從而造成突變。,DNA損傷與藥物評價,1.遺傳毒性試驗(yàn)遺傳毒性研究在藥物研發(fā)中處于比較的重要位置。遺傳毒性試驗(yàn)?zāi)軝z出DNA損傷及其損傷的固定。以基因

42、突變、較大范圍染色體損傷、重組和染色體數(shù)目改變形式出現(xiàn)的DNA損傷的固定，一般被認(rèn)為是可遺傳效應(yīng)的基礎(chǔ)，并且是惡性腫瘤發(fā)展過程的環(huán)節(jié)之一。在檢測這些類別損傷的試驗(yàn)中呈陽性的化合物為潛在人類致癌劑和/或致突變劑。由于在人體中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之間的關(guān)系，而對于遺傳性疾病尚難以證明有類似的關(guān)系，故遺傳毒性試驗(yàn)主要用于致癌性預(yù)測。,實(shí)驗(yàn)方法,Ames試驗(yàn)?。ㄎ廴疚镏峦蛔冃詸z測）是檢測化學(xué)物質(zhì)基因突變的常用方法。,沙門氏菌回

43、復(fù)突變試驗(yàn),鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his－）菌株，在含微量組氨酸的培養(yǎng)基中，除極少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)胞外，一般只能分裂幾次，形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后，大量細(xì)胞發(fā)生回復(fù)突變，自行合成組氨酸，發(fā)育成肉眼可見的菌落。,在評價突變危害中常用的有特殊重要意義的試驗(yàn),TK基因突變試驗(yàn),TK基因突變試驗(yàn)是一種哺乳動物體細(xì)胞基因正向突變試驗(yàn),近年來其應(yīng)用價值有明顯的提高。

44、 TK基因突變試驗(yàn)的檢測終點(diǎn)是胸苷激酶（thymidine kinase，TK）基因的突變。在人類，TK基因定位于17號染色體長臂遠(yuǎn)端；在小鼠則定位于11號染色體。故TK基因的突變屬于常染色體基因突變。,TK基因的產(chǎn)物胸苷激酶在體內(nèi)催化從脫氧胸苷（TdR）生成胸苷酸（TMP）的反應(yīng)。在正常情況下，此反應(yīng)并非生命所必需，原因是體內(nèi)的TMP主要來自于脫氧尿嘧啶核苷酸（dUMP），即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反應(yīng)生成TMP。但如在

45、細(xì)胞培養(yǎng)物中加入胸苷類似物（如三氟胸苷，即TFT——trifluorothymidine），則TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，進(jìn)而摻入DNA，造成致死性突變，故細(xì)胞不能存活。若TK基因發(fā)生突變，導(dǎo)致胸苷激酶缺陷，則TFT不能磷酸化，亦不能摻入DNA，故細(xì)胞在含有TFT的培養(yǎng)基中能夠生長，即表現(xiàn)出對TFT的抗性。根據(jù)突變集落形成數(shù)，計算突變頻率，以判定受試物的致突變性。,試驗(yàn)采用的靶細(xì)胞系主要有小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y以及人類

46、淋巴母細(xì)胞TK6和WTK1等。其基因型均為tk+/-。TK基因突變試驗(yàn)可檢出包括點(diǎn)突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大范圍基因組改變在內(nèi)的多種遺傳改變。,轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變試驗(yàn),轉(zhuǎn)基因小鼠基因突變試驗(yàn)可在整體狀態(tài)下檢測基因突變,比較不同組織(包括生殖腺)的突變率,確定靶器官,對誘發(fā)的遺傳改變作精確分析等。國外已陸續(xù)發(fā)展了多種用于突變檢測的轉(zhuǎn)基因動物,其中3種已投入商品化生產(chǎn),MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xe

47、nomouse小鼠,它們分別采用大腸桿菌乳糖操縱子的LacZ和/或Lacl作為誘變的靶基因。,反向限制性酶切位點(diǎn)突變分析法(inverserestrictionsitemutation,iRSM),iRSM適用于快速檢測誘變劑所致體內(nèi)外DNA的突變，這些突變的特點(diǎn)是使某一酶切位點(diǎn)變?yōu)榱硪幻盖形稽c(diǎn)。該方法建立者Jenkins等首先將iRSM應(yīng)用于化學(xué)誘變劑所致動物體內(nèi)p53基因的突變檢測:小鼠分別口服N-乙基N-亞硝基脲(ENU)、2

48、-乙酰氨基芴(2-AAF)和二甲基酰肼(DMH)3天后,以iRSM方法相應(yīng)地檢測小鼠脾、骨髓和肝組織p53基因第6內(nèi)含子區(qū)域的Apa→Ava位點(diǎn)反向突變。結(jié)果表明ENU誘發(fā)肝組織p53基因突變的發(fā)生率為33%,2-AAF使肝組織突變的發(fā)生率為25%,這一陽性突變率反映出了不同誘變劑對相應(yīng)組織的致突變強(qiáng)度,進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的高靈敏度和準(zhǔn)確性。它具有靈敏度高、快速、操作簡便、以及突變檢測部位明確等優(yōu)點(diǎn),是一種較具實(shí)用價值和生命力的突變檢測

49、手段。,但是,iRSM的不足之處是僅能檢測誘發(fā)限制性酶切位點(diǎn)反向的DNA突變。根據(jù)文獻(xiàn)資料分析,化合物致突的發(fā)生具有一定的規(guī)律性,即結(jié)構(gòu)類似的一組化合物常常引起一些特定序列較固定的堿基改變。例如,烷化劑和芳香胺類易使一連串鳥嘌呤(G)3′端G發(fā)生突變,這可能與該部位電荷密集有關(guān),多數(shù)活性氧生成物質(zhì)的DNA致突作用也具有類似規(guī)律;CpG二核苷常常是DNA加成物致突變作用部位,所以CpG突變的檢測在化合物致突檢測中具有重要意義,而CpG突

50、變常引發(fā)某些固定酶切位點(diǎn)的變化。很顯然,iRSM可較廣泛地應(yīng)用于遺傳毒性化合物致突作用的檢測。,檢測染色體和染色體組畸變,微核試驗(yàn)　微核試驗(yàn)是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗(yàn)方法。是檢測化學(xué)物質(zhì)染色體損傷的基本方法。,方法：最常用的是嚙齒類動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞(PCE)微核試驗(yàn)。以受試物處理嚙齒類動物，然后處死，取骨髓，制片、固定、染色，于顯微鏡下計數(shù)PCE中的微核。,染色體畸變試驗(yàn)　染色體畸變試驗(yàn)是檢測化學(xué)物質(zhì)影響染

51、色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)的基本方法。,熒光原位雜交(FISH)技術(shù),熒光原位雜交最早由Bauman(1980)建立,后由Lucas(1989)首先應(yīng)用于染色體畸變分析。其原理是按檢測目標(biāo)準(zhǔn)備恰當(dāng)?shù)腄NA序列作為探針,并用生物素標(biāo)記,對載玻片上待測標(biāo)本中的DNA雜交,最后通過雜交位點(diǎn)的熒光觀察染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目的改變。,應(yīng)用特殊染色體和染色體某區(qū)域的熒光探針可在體內(nèi)檢測4種類型的細(xì)胞遺傳學(xué)終點(diǎn)。1檢測中期細(xì)胞染色體畸變。2應(yīng)用亞染色體區(qū)域的探針

52、檢測間期染色體斷裂和非整倍體。3應(yīng)用中心粒探針和/或抗著絲點(diǎn)抗體檢測微核的形成。Schriever-Schwemmet等利用CREST間接免疫熒光法,以及小鼠次要和主要衛(wèi)星DNA探針,在小鼠骨髓細(xì)胞證明了受試物引起微核的來源。4哺乳動物精子非整倍體檢測。,檢測DNA原始損傷,單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)　單細(xì)胞凝膠電泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首創(chuàng)的,以后經(jīng)Sing