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文檔簡介
1、研究背景與目的: 細胞基因組DNA隨時遭受DNA損傷的侵襲,其中引起細胞內(nèi)DNA損傷的因素主要包括內(nèi)源性因素和外源性因素,其中內(nèi)源性因素有:復制錯誤;隨機堿基損傷(脫氨基作用、脫嘌呤作用);代謝產(chǎn)物(氧自由基等因素引起的堿基氧化、甲基化、水解、錯配等)。外源性因素有:化學性的(化學誘變劑堿基類似物5-BU、羥氨類(NH20H)、亞硝酸鹽(NO2)、烷化劑如氮芥類等);物理性的(紫外線、γ射線等)。面對種類繁多、數(shù)目巨大的DNA損
2、傷,細胞擁有完善的DNA損傷應答機制,細胞會啟動各種損傷修復機制或凋亡途徑,使細胞DNA損傷得到修復,或使無法修復的細胞選擇凋亡。如果細胞的損傷修復機制或凋亡系統(tǒng)失常,即DNA損傷得不到正確修復或不能凋亡,細胞基因組DNA將大量積累突變,乃至染色體畸變,導致DNA高突變型細胞的產(chǎn)生,最終導致癌基因的激活,原癌基因的失活,細胞由高突變表型變成腫瘤表型。 針對不同的損傷機制可采用不同的損傷修復機制,如隨機堿基損傷可采用堿基切除修復、
3、堿基甲基化可采用直接修復、紫外線導致的DNA損傷可采用核苷酸切除修復等。在眾多的DNA損傷修復機制中,近年來在生物細胞中發(fā)現(xiàn)了一種由Y家族DNA聚合酶介導的跨損傷復制機制。Y家族DNA聚合酶對DNA損傷引起的空間結(jié)構(gòu)的扭曲高度耐受,能以損傷的DNA為模板進行復制,以保證DNA復制的正常進行,幫助帶有損傷DNA的細胞度過難關(guān)不致死亡。但是Y家族DNA聚合酶可不依據(jù)嚴格的堿基互補配對原則同時缺乏缺乏3’-5’核酸外切酶活性,因此沒有錯配堿基
4、的校正閱讀功能,所以復制DNA時有很高的堿基錯配傾向[1-3],故又稱為錯配傾向聚合酶。Polι屬于Y家族的DNA聚合酶之一,體外研究初步闡明了Polι DNA復制保真性很低,是目前發(fā)現(xiàn)的保真性最低的聚合酶,其保真性較高保真聚合酶低1000-10000倍:同時主要的生物學功能為實施某些DNA損傷后的跨損傷復制。但是其體內(nèi)的生物學功能尚不清楚,本課題組以前的工作發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細胞中Polι過度表達,并可能參與了乳腺癌細胞中基因組高突變型的形
5、成。同時首次發(fā)現(xiàn)并成功克隆了Polι的同源異構(gòu)體,由于該異構(gòu)體比Polι少第5個外顯子,故命名為Polιs5,但Polιs5的功能尚不得知。為了進一步研究Polι及Polιs5體內(nèi)的生物學功能,以及跨損傷復制在遺傳不穩(wěn)定性產(chǎn)生中的作用,我們將構(gòu)建穩(wěn)定高表達Polι或Polιs5的HEK-293細胞系,采用紫外線(UVC,256nm)DNA損傷,利用激光共聚焦技術(shù),通過對比Polι及Polιs5在UV損傷前后的細胞定位改變,觀察Polι及
6、Polιs5是否在DNA損傷后聚集到復制叉上,證實Polι及Polιs5參與體內(nèi)DNA損傷后跨損傷復制過程;進一步,通過MTT法、體內(nèi)突變檢測系統(tǒng),研究Polι及Polιs5介導的跨損傷復制的生物學功能。 方法: 1、HEK-293穩(wěn)定高表達Polι(Polι-HEK-293)或Polιs5(pohs5-HEK-293)細胞系的建立。pcDNA3.1-Polι和pcDNA3.1-Polιs5由本實驗室保存。利用氯化鈣法將
7、兩個質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌,經(jīng)過質(zhì)粒小抽,初步鑒定后,進行測序,將測序結(jié)果利用生物信息技術(shù)BLAT(www.genome.ucsc.edu)進行鑒定。以證明pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外顯子,為我們進一步對Polι與Polιs5的功能對比研究奠定基礎(chǔ)。HEK-293細胞經(jīng)胰酶消化后,接種到35mm培養(yǎng)皿中,參照LipofectamineTM20
8、00脂質(zhì)體操作說明,將lipofectamine2000- DNA復合物加入培養(yǎng)板中,37℃,5%CO2培養(yǎng)4小時后,換入含有血清的DMEM培養(yǎng)基,生長24小時后,傳代致六孔板中,再培養(yǎng)48小時后,將培養(yǎng)基換為含有600ug/mlG418的培養(yǎng)基進行穩(wěn)定篩選。篩選出的抗G418的克隆經(jīng)RT-PCR檢測選出高表達目的基因的細胞克隆。 2、Polι與Polιs5細胞定位研究。通過用激光共聚焦顯微鏡檢測細胞在受到紫外線UVC照射后Po
9、lι及Polιs5在細胞核分布的改變分析其功能差異。培養(yǎng)HEK293細胞,利用陽離子脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染的方法,將質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞,36小時后,用紫外線UVC(15J/m2)照射使細胞DNA損傷,4小時后用激光共聚焦顯微鏡觀察在質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分別瞬時轉(zhuǎn)染的HEK293細胞,細胞內(nèi)綠色熒光蛋白
10、在紫外線照射前后分布的改變。 3、Polι與Polιs5對紫外損傷耐受的功能對比研究。HEK-293、Polι-HEK-293和Polιs5-HEK-293用胰酶消化后,按8000個/孔鋪板于96孔板中,第二天細胞貼壁后,將培養(yǎng)基吸干,用不同劑量的紫外線照射細胞,加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),24小時或72小時后用MTT法檢測細胞生存率。 4、Polι與Polιs5介導UV損傷后基因突變發(fā)生的對比研究。分別用1500 J/m2,3
11、000J/m2的紫外劑量照射pSupFG1質(zhì)粒后,將其分別轉(zhuǎn)染入HEK-293、Polι-HEK-293和Polιs5-HEK-293細胞培養(yǎng)48小時后;提取細胞內(nèi)的supF質(zhì)粒,用Dpn I酶切三個小時,然后將其電轉(zhuǎn)入SY204細菌;將細菌鋪板在含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的平板上,長出藍白斑,數(shù)藍白斑數(shù)量計算突變頻率;挑出白斑搖菌送往上海生工公司測序,統(tǒng)計突變頻譜。 結(jié)果: 1、成功將質(zhì)粒pcDNA3.1-P
12、olι和pcDNA3.1-Polιs5轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌,并進行質(zhì)粒小抽,初步鑒定后將質(zhì)粒進行測序,將測序結(jié)果利用生物信息技術(shù)BLAT(www.genome.ucsc.edu)證明:pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外顯子,為我們進一步對Polι與Polιs5的功能對比研究奠定了基礎(chǔ)。我們通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功將我們的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK-293細胞,通過G418
13、篩選,最終獲得抗G418抗性的細胞克隆。通過Tripure分離提取細胞總RNA,電泳結(jié)果顯示:18S和28S條帶顯示清晰,28S條帶的強度約為18S條帶的2倍,5S條帶極弱,未見DNA污染條帶出現(xiàn),表明所提取的RNA完整性好,純度可靠.可以滿足RT-PCR實驗的要求。通過RT-PCR初步檢測結(jié)果表明:在具有G418抗性的HEK-293細胞中,檢測到Polι、Polιs5表達量增加的細胞克隆,其表達量高于未轉(zhuǎn)染HEK-293細胞。
14、 2、通過質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5瞬時轉(zhuǎn)染HEK293細胞48小時后,激光共聚焦檢測,結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率高,在正常條件下,對照EGFP蛋白均勻分布于細胞漿與細胞核內(nèi),Polι及Polιs5則大多均勻分布于細胞核,為核蛋白。在UV(15J/m2)照射4小時后,對照EGFP蛋白仍均勻分布于細胞漿與細胞核內(nèi);Polι及Polιs5則均出現(xiàn)細胞核內(nèi)局部熒光聚集現(xiàn)象,形成復制鏡像,證實Pol
15、ιs5與Polι參與紫外線UVC導致的DNA損傷的跨損傷復制過程。 3、用不同劑量的紫外線照射細胞后24小時,用MTT法測細胞存活率。HEK-293細胞存活率由100%下降到72%;穩(wěn)定高表達Polι-HEK-293細胞存活率由100%下降到76%;穩(wěn)定高表達Polιs5的Polιs5-HEK-293細胞存活率由100%下降到82%;經(jīng)過統(tǒng)計學分析三者之間沒有明顯差異。 用不同劑量的紫外線照射細胞后72小時,用MTT法測
16、細胞存活率。HEK-293細胞存活率由100%下降到16%; Polι-HEK-293細胞存活率由100%下降到12%;Polιs5-HEK-293細胞存活率由100%下降到14%;經(jīng)過統(tǒng)計學分析三者之間沒有明顯差異。 4、我們將pSupFG1質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入HEK-293、Polι-HEK-293、Polιs5-HEK-293,并提取出細胞內(nèi)PsupFGl質(zhì)粒,然后高效的將其轉(zhuǎn)入SY204細菌,最后鋪板數(shù)出藍白斑得出突變頻率,通過
17、挑白斑搖菌測序得出突變頻譜。結(jié)果顯示Polι或Polιs5在細胞內(nèi)的過度表達將導致DNA損傷后誘發(fā)高突變的產(chǎn)生,并具有一定的突變特征。 結(jié)論: 1.成功構(gòu)建了穩(wěn)定Polι或Polιs5高表達的細胞模型,為進一步研究Polι和Polιs5的體內(nèi)生物學功能奠定基礎(chǔ)。 2.證實Polι和Polιs5能參與細胞紫外損傷后的細胞應答過程。 3.Polι和Polιs5對紫外線損傷后的細胞的生存沒有影響。 4.
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