DNA聚合酶polι及其新型剪接變異體的跨損傷復(fù)制功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景與目的： 細(xì)胞基因組DNA隨時(shí)遭受DNA損傷的侵襲，其中引起細(xì)胞內(nèi)DNA損傷的因素主要包括內(nèi)源性因素和外源性因素，其中內(nèi)源性因素有：復(fù)制錯(cuò)誤；隨機(jī)堿基損傷(脫氨基作用、脫嘌呤作用)；代謝產(chǎn)物(氧自由基等因素引起的堿基氧化、甲基化、水解、錯(cuò)配等)。外源性因素有：化學(xué)性的(化學(xué)誘變劑堿基類似物5-BU、羥氨類(NH20H)、亞硝酸鹽(NO2)、烷化劑如氮芥類等)；物理性的(紫外線、γ射線等)。面對(duì)種類繁多、數(shù)目巨大的DNA損

2、傷，細(xì)胞擁有完善的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)各種損傷修復(fù)機(jī)制或凋亡途徑，使細(xì)胞DNA損傷得到修復(fù)，或使無(wú)法修復(fù)的細(xì)胞選擇凋亡。如果細(xì)胞的損傷修復(fù)機(jī)制或凋亡系統(tǒng)失常，即DNA損傷得不到正確修復(fù)或不能凋亡，細(xì)胞基因組DNA將大量積累突變，乃至染色體畸變，導(dǎo)致DNA高突變型細(xì)胞的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致癌基因的激活，原癌基因的失活，細(xì)胞由高突變表型變成腫瘤表型。 針對(duì)不同的損傷機(jī)制可采用不同的損傷修復(fù)機(jī)制，如隨機(jī)堿基損傷可采用堿基切除修復(fù)、

3、堿基甲基化可采用直接修復(fù)、紫外線導(dǎo)致的DNA損傷可采用核苷酸切除修復(fù)等。在眾多的DNA損傷修復(fù)機(jī)制中，近年來(lái)在生物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了一種由Y家族DNA聚合酶介導(dǎo)的跨損傷復(fù)制機(jī)制。Y家族DNA聚合酶對(duì)DNA損傷引起的空間結(jié)構(gòu)的扭曲高度耐受，能以損傷的DNA為模板進(jìn)行復(fù)制，以保證DNA復(fù)制的正常進(jìn)行，幫助帶有損傷DNA的細(xì)胞度過(guò)難關(guān)不致死亡。但是Y家族DNA聚合酶可不依據(jù)嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則同時(shí)缺乏缺乏3’-5’核酸外切酶活性，因此沒(méi)有錯(cuò)配堿基

4、的校正閱讀功能，所以復(fù)制DNA時(shí)有很高的堿基錯(cuò)配傾向[1-3]，故又稱為錯(cuò)配傾向聚合酶。Polι屬于Y家族的DNA聚合酶之一，體外研究初步闡明了Polι DNA復(fù)制保真性很低，是目前發(fā)現(xiàn)的保真性最低的聚合酶，其保真性較高保真聚合酶低1000-10000倍：同時(shí)主要的生物學(xué)功能為實(shí)施某些DNA損傷后的跨損傷復(fù)制。但是其體內(nèi)的生物學(xué)功能尚不清楚，本課題組以前的工作發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中Polι過(guò)度表達(dá)，并可能參與了乳腺癌細(xì)胞中基因組高突變型的形

5、成。同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)并成功克隆了Polι的同源異構(gòu)體，由于該異構(gòu)體比Polι少第5個(gè)外顯子，故命名為Polιs5，但Polιs5的功能尚不得知。為了進(jìn)一步研究Polι及Polιs5體內(nèi)的生物學(xué)功能，以及跨損傷復(fù)制在遺傳不穩(wěn)定性產(chǎn)生中的作用，我們將構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)Polι或Polιs5的HEK-293細(xì)胞系，采用紫外線(UVC，256nm)DNA損傷，利用激光共聚焦技術(shù)，通過(guò)對(duì)比Polι及Polιs5在UV損傷前后的細(xì)胞定位改變，觀察Polι及

6、Polιs5是否在DNA損傷后聚集到復(fù)制叉上，證實(shí)Polι及Polιs5參與體內(nèi)DNA損傷后跨損傷復(fù)制過(guò)程；進(jìn)一步，通過(guò)MTT法、體內(nèi)突變檢測(cè)系統(tǒng)，研究Polι及Polιs5介導(dǎo)的跨損傷復(fù)制的生物學(xué)功能。 方法： 1、HEK-293穩(wěn)定高表達(dá)Polι(Polι-HEK-293)或Polιs5(pohs5-HEK-293)細(xì)胞系的建立。pcDNA3.1-Polι和pcDNA3.1-Polιs5由本實(shí)驗(yàn)室保存。利用氯化鈣法將

7、兩個(gè)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入DH5α大腸桿菌，經(jīng)過(guò)質(zhì)粒小抽，初步鑒定后，進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果利用生物信息技術(shù)BLAT(www.genome.ucsc.edu)進(jìn)行鑒定。以證明pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外顯子，為我們進(jìn)一步對(duì)Polι與Polιs5的功能對(duì)比研究奠定基礎(chǔ)。HEK-293細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，接種到35mm培養(yǎng)皿中，參照LipofectamineTM20

8、00脂質(zhì)體操作說(shuō)明，將lipofectamine2000- DNA復(fù)合物加入培養(yǎng)板中，37℃，5％CO2培養(yǎng)4小時(shí)后，換入含有血清的DMEM培養(yǎng)基，生長(zhǎng)24小時(shí)后，傳代致六孔板中，再培養(yǎng)48小時(shí)后，將培養(yǎng)基換為含有600ug/mlG418的培養(yǎng)基進(jìn)行穩(wěn)定篩選。篩選出的抗G418的克隆經(jīng)RT-PCR檢測(cè)選出高表達(dá)目的基因的細(xì)胞克隆。 2、Polι與Polιs5細(xì)胞定位研究。通過(guò)用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞在受到紫外線UVC照射后Po

9、lι及Polιs5在細(xì)胞核分布的改變分析其功能差異。培養(yǎng)HEK293細(xì)胞，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，將質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，36小時(shí)后，用紫外線UVC(15J/m2)照射使細(xì)胞DNA損傷，4小時(shí)后用激光共聚焦顯微鏡觀察在質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白

10、在紫外線照射前后分布的改變。 3、Polι與Polιs5對(duì)紫外損傷耐受的功能對(duì)比研究。HEK-293、Polι-HEK-293和Polιs5-HEK-293用胰酶消化后，按8000個(gè)/孔鋪板于96孔板中，第二天細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基吸干，用不同劑量的紫外線照射細(xì)胞，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)或72小時(shí)后用MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率。 4、Polι與Polιs5介導(dǎo)UV損傷后基因突變發(fā)生的對(duì)比研究。分別用1500 J/m2，3

11、000J/m2的紫外劑量照射pSupFG1質(zhì)粒后，將其分別轉(zhuǎn)染入HEK-293、Polι-HEK-293和Polιs5-HEK-293細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后；提取細(xì)胞內(nèi)的supF質(zhì)粒，用Dpn I酶切三個(gè)小時(shí)，然后將其電轉(zhuǎn)入SY204細(xì)菌；將細(xì)菌鋪板在含有X-gal、IPTG和氨芐青霉素的平板上，長(zhǎng)出藍(lán)白斑，數(shù)藍(lán)白斑數(shù)量計(jì)算突變頻率；挑出白斑搖菌送往上海生工公司測(cè)序，統(tǒng)計(jì)突變頻譜。 結(jié)果： 1、成功將質(zhì)粒pcDNA3.1-P

12、olι和pcDNA3.1-Polιs5轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，并進(jìn)行質(zhì)粒小抽，初步鑒定后將質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果利用生物信息技術(shù)BLAT(www.genome.ucsc.edu)證明：pcDNA3.1-Polιs5的目的片段Polιs5比pcDNA3.1-Polι的目的片段Polι少Polι的第5外顯子，為我們進(jìn)一步對(duì)Polι與Polιs5的功能對(duì)比研究奠定了基礎(chǔ)。我們通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法成功將我們的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HEK-293細(xì)胞，通過(guò)G418

13、篩選，最終獲得抗G418抗性的細(xì)胞克隆。通過(guò)Tripure分離提取細(xì)胞總RNA，電泳結(jié)果顯示：18S和28S條帶顯示清晰，28S條帶的強(qiáng)度約為18S條帶的2倍，5S條帶極弱，未見(jiàn)DNA污染條帶出現(xiàn)，表明所提取的RNA完整性好，純度可靠.可以滿足RT-PCR實(shí)驗(yàn)的要求。通過(guò)RT-PCR初步檢測(cè)結(jié)果表明：在具有G418抗性的HEK-293細(xì)胞中，檢測(cè)到Polι、Polιs5表達(dá)量增加的細(xì)胞克隆，其表達(dá)量高于未轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞。

14、 2、通過(guò)質(zhì)粒pEGFP-C1、pEGFP-C1-Polι、pEGFP-C1-Polιs5瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞48小時(shí)后，激光共聚焦檢測(cè)，結(jié)果顯示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率高，在正常條件下，對(duì)照EGFP蛋白均勻分布于細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)，Polι及Polιs5則大多均勻分布于細(xì)胞核，為核蛋白。在UV(15J/m2)照射4小時(shí)后，對(duì)照EGFP蛋白仍均勻分布于細(xì)胞漿與細(xì)胞核內(nèi)；Polι及Polιs5則均出現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)局部熒光聚集現(xiàn)象，形成復(fù)制鏡像，證實(shí)Pol

15、ιs5與Polι參與紫外線UVC導(dǎo)致的DNA損傷的跨損傷復(fù)制過(guò)程。 3、用不同劑量的紫外線照射細(xì)胞后24小時(shí)，用MTT法測(cè)細(xì)胞存活率。HEK-293細(xì)胞存活率由100％下降到72％；穩(wěn)定高表達(dá)Polι-HEK-293細(xì)胞存活率由100％下降到76％；穩(wěn)定高表達(dá)Polιs5的Polιs5-HEK-293細(xì)胞存活率由100％下降到82％；經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析三者之間沒(méi)有明顯差異。 用不同劑量的紫外線照射細(xì)胞后72小時(shí)，用MTT法測(cè)

16、細(xì)胞存活率。HEK-293細(xì)胞存活率由100％下降到16％； Polι-HEK-293細(xì)胞存活率由100％下降到12％；Polιs5-HEK-293細(xì)胞存活率由100％下降到14％；經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析三者之間沒(méi)有明顯差異。 4、我們將pSupFG1質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入HEK-293、Polι-HEK-293、Polιs5-HEK-293，并提取出細(xì)胞內(nèi)PsupFGl質(zhì)粒，然后高效的將其轉(zhuǎn)入SY204細(xì)菌，最后鋪板數(shù)出藍(lán)白斑得出突變頻率，通過(guò)

17、挑白斑搖菌測(cè)序得出突變頻譜。結(jié)果顯示Polι或Polιs5在細(xì)胞內(nèi)的過(guò)度表達(dá)將導(dǎo)致DNA損傷后誘發(fā)高突變的產(chǎn)生，并具有一定的突變特征。 結(jié)論： 1.成功構(gòu)建了穩(wěn)定Polι或Polιs5高表達(dá)的細(xì)胞模型，為進(jìn)一步研究Polι和Polιs5的體內(nèi)生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。 2.證實(shí)Polι和Polιs5能參與細(xì)胞紫外損傷后的細(xì)胞應(yīng)答過(guò)程。 3.Polι和Polιs5對(duì)紫外線損傷后的細(xì)胞的生存沒(méi)有影響。 4.