近親結(jié)婚導(dǎo)致的遺傳性FⅤ缺陷癥和FⅦ缺陷癥家系的基因分析.pdf

1、凝血因子是維持機(jī)體出血與止血平衡的重要因素之一，凝血因子含量或功能發(fā)生改變時(shí)，就有可能導(dǎo)致出血或血栓性疾病。遺傳性凝血因子缺陷癥為一類單基因遺傳性疾病，發(fā)病率雖然比較低，但危害性大并且致死率高，嚴(yán)重影響患者本人及其后代。近親結(jié)婚的家系患病風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)比非近親結(jié)婚家系高，對(duì)近親結(jié)婚導(dǎo)致該類疾病的家系進(jìn)行基因分析及分子發(fā)病機(jī)制研究，不僅有助于探索凝血因子結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，而且為早期診斷、產(chǎn)前篩查提供了理論依據(jù)。本研究對(duì)近親結(jié)婚導(dǎo)致的1例遺傳性

2、凝血因子Ⅴ(coagulation factorⅤ，F(xiàn)Ⅴ)缺陷癥家系和1例遺傳性凝血因子Ⅻ(coagulation factorⅫ，F(xiàn)Ⅻ)缺陷癥家系進(jìn)行了表型診斷和基因分析。
　　 一、近親結(jié)婚導(dǎo)致的遺傳性FⅤ缺陷癥家系的研究
　　 目的：FⅤ是由凝血酶原復(fù)合物催化快速生成凝血酶所必須的蛋白輔因子，在凝血過程中非常重要。生理環(huán)境下，F(xiàn)Ⅴ通過其既能促凝又能抗凝的雙重作用參與并維持凝血與抗凝的動(dòng)態(tài)平衡。遺傳性FⅤ缺陷癥(in

3、herited factorⅤ deficiency)是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病，由于遺傳性FⅤ缺陷癥發(fā)病率低且FⅤ基因較復(fù)雜，分子發(fā)病機(jī)制的研究目前仍較少，只有少數(shù)病例清楚。本研究對(duì)1例由近親結(jié)婚引起純合突變的遺傳性FⅤ缺陷癥患者及家系成員進(jìn)行表型及基因分析，探討其相關(guān)的分子發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.研究對(duì)象
　　 1.1 家系資料:先證者，男，50歲，浙江溫州人，因“乏力伴呼吸費(fèi)力”就診，住

4、院常規(guī)凝血功能檢查發(fā)現(xiàn)凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)及活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)均明顯延長(zhǎng)，患者無肝腎功能障礙，自訴平素?zé)o自發(fā)出血病史。進(jìn)一步檢測(cè)凝血因子Ⅴ活性(factorⅤactivity, FⅤ∶C)為8％，凝血因子Ⅴ抗原(factorⅤ antigen，F(xiàn)Ⅴ∶Ag)＜1％，均極度下降。該家系共2代9名成員，家系中其他成員除了

5、先證者妹妹十多年前有產(chǎn)后大出血病史外，均無自發(fā)出血史。先證者父母為姨表近親婚配。
　　 1.2 正常對(duì)照者:我院健康體檢者120例，男性66名，女性54名，平均34(24-55)歲。對(duì)照組采樣前均取得知情同意，且經(jīng)查實(shí)均無肝腎功能疾病，無出血或血栓性疾病史。
　　 2.研究方法
　　 2.1 樣本采集及處理取得患者、家系成員及對(duì)照組體檢者的知情同意后，采集靜脈血與0.109mol/L枸櫞酸鈉以9∶1抗凝，4℃30

6、00rpm離心15min，將得到的乏血小板血漿分裝后-40℃保存。抽提基因組脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)，-40℃保存待用。
　　 2.2 表型檢測(cè)
　　 采用一期凝固法在STAGO STA-R全自動(dòng)血凝儀上測(cè)定PT、APTT、纖維蛋白原（fibfinogen，F(xiàn)IB）、凝血因子Ⅱ活性（factorⅡ activity，F(xiàn)Ⅱ∶C）、FⅤ∶C、凝血因子Ⅶ活性（factorⅦactiv

7、ity,FⅦ∶C）、凝血因子Ⅷ活性（factorⅧactivity,FⅧ∶C）及凝血因子Ⅹ活性（factorⅩ activity，F(xiàn)Ⅹ∶C）等;采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunoadsorbent assay，ELISA)檢測(cè)FⅤ∶Ag（由上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院血栓與止血實(shí)驗(yàn)室完成）。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。
　　 2.3 家系基因分析根據(jù)FⅤ基因序列(GenBankAY364535

8、)，應(yīng)用Primer Premier5.0TM軟件及參考相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)31對(duì)引物以覆蓋FⅤ基因的25個(gè)外顯子區(qū)域及其側(cè)翼。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)在ABI Thermal cycler2720擴(kuò)增儀上進(jìn)行，PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物工程有限公司，在ABI PRISM3730測(cè)序儀上采用雙脫氧鏈終止法測(cè)序。用Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果與美國(guó)國(guó)立生物信息中心(National Center

9、for Biotechnology Information，NCBI)中的FⅤ基因序列(AY364535)進(jìn)行比對(duì)(Blast)，找尋基因突變位點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.表型檢測(cè)結(jié)果先證者與其妹妹PT及APTT均明顯延長(zhǎng)，F(xiàn)Ⅴ∶C和FⅤ∶Ag極度減低;家系其他成員的PT及APTT均在正常參考范圍內(nèi)。先證者的大哥、姐姐、大女兒、小女兒和外甥女的FⅤ∶C和FⅤ∶Ag都有不同程度的減低。先證者及家系成員的其它凝血指標(biāo)均無明

10、顯異常。
　　 2.家系基因分析結(jié)果先證者FⅤ基因第5外顯子的29170位發(fā)生T→C純合突變，導(dǎo)致190位氨基酸苯丙氨酸被替換為絲氨酸(Phe190Ser)，其表型檢測(cè)異常的妹妹也有此純合突變;大哥、姐姐、大女兒、小女兒和外甥女均為g.29170 T→C雜合突變;二哥和弟弟為正常野生型。
　　 結(jié)論：
　　 1.該遺傳性FⅤ缺陷癥家系先證者及其妹妹FⅤ基因第5外顯子存在純合型錯(cuò)義突變Phe190Ser，推測(cè)與父母

11、近親結(jié)婚有關(guān)。
　　 2.Phe190Ser與該遺傳性FⅤ缺陷癥家系FⅤ水平降低有關(guān)。
　　 二、近親結(jié)婚導(dǎo)致的遺傳性FⅫ缺陷癥家系的研究
　　 目的：遺傳性FⅫ缺陷癥(inherited factorⅫdeficiency)，是一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病?；颊咄ǔ]有出血傾向，反而有血栓形成的危險(xiǎn)，部分患者常因術(shù)前凝血常規(guī)檢查顯示APTT延長(zhǎng)而被發(fā)現(xiàn)。本研究對(duì)1例由姑表近親結(jié)婚引起純合突變的遺傳性FⅫ缺陷

12、癥患者及家系成員進(jìn)行表型及基因分析，探討其分子發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.研究對(duì)象
　　 1.1 家系資料:先證者，男，35歲，浙江溫州瑞安人。因“咯血”就診，常規(guī)凝血功能檢查發(fā)現(xiàn)APTT明顯延長(zhǎng)，先證者肝腎功能正常，既往無出血史，無長(zhǎng)期服藥史。進(jìn)一步檢測(cè)凝血因子Ⅻ活性（factorⅫ activity，F(xiàn)Ⅻ∶C）＜1％，凝血因子Ⅻ抗原(factorⅫantigen，F(xiàn)Ⅻ∶Ag)＜1％，均極度下降。該家系

13、共3代5名成員，先證者及家系成員均無出血癥狀，先證者父母為姑表近親婚配。
　　 1.2 正常對(duì)照者:（同遺傳性FⅤ缺陷癥分析）
　　 2.研究方法
　　 2.1 樣本采集、處理及表型檢測(cè):（同遺傳性FⅤ缺陷癥分析）
　　 2.2 家系基因分析根據(jù)FⅫ基因序列(GenBank AF538691)，應(yīng)用Primer Premier5.0TM軟件及參考相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)7對(duì)引物以覆蓋FⅫ基因所有區(qū)域。PCR反應(yīng)在A

14、BI Thermal cycler2720擴(kuò)增儀上進(jìn)行，產(chǎn)物送上海桑尼生物工程有限公司測(cè)序。用Chromas軟件將測(cè)序結(jié)果與NCBI中的FⅫ基因序列(AF538691)進(jìn)行比對(duì)(Blast)，找尋基因突變位點(diǎn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.表型檢測(cè)結(jié)果先證者APTT明顯延長(zhǎng)，兒子APTT輕度延長(zhǎng)，家系其他成員都在正常范圍內(nèi)。先證者FⅫ∶C和FⅫ∶Ag＜1.0％，家系成員FⅫ∶C和FⅫ∶Ag都有不同程度的下降。
　　

15、2.家系基因分析結(jié)果先證者及其家系成員FⅫ基因第1外顯子啟動(dòng)子區(qū)46位多態(tài)性均為46T/T，先證者FⅫ基因第14外顯子上出現(xiàn)g.8699G→A純合型錯(cuò)義突變，第542位氨基酸甘氨酸變成絲氨酸(Gly542Ser)，先證者母親、兒子、女兒均為該突變的雜合型。
　　 結(jié)論：
　　 1.該遺傳性FⅫ缺陷癥家系先證者第14外顯子存在純合型錯(cuò)義突變Gly542Ser，推測(cè)與父母近親結(jié)婚有關(guān)。
　　 2.Gly542Ser和