一個(gè)遺傳性凝血因子?缺陷癥家系f?基因分析

1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文一個(gè)遺傳性凝血因子Ⅻ缺陷癥家系FⅫ基因分析姓名：謝海嘯申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)指導(dǎo)教師：王明山20090501溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。四、遺傳性F Ⅻ缺陷癥家系基因分析根據(jù)F Ⅻ基因序列( G e n B a n k A F 5 3 8 6 9 1 ) ，應(yīng)用p r i n e r 5 軟件共設(shè)計(jì)7 對引物以覆蓋F Ⅻ基因的所有外顯子區(qū)域及其側(cè)翼序列( 見表2 ) 。P

2、 C R 反應(yīng)在P c R 擴(kuò)增儀( ^ B lT h e r m lc y c l e r2 7 2 0 ，U s A ) 上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：9 ．5 ℃預(yù)變性5 m i n ，然后9 5 ℃變性3 0 s ，根據(jù)引物不同分別在相應(yīng)退火溫度( 6 0 1 2 ～6 4 ℃) 退火3 0 s ，7 2 ℃延伸l a i n ，共3 0 個(gè)循環(huán)，7 2 ℃延伸l O m i n 。P C R 產(chǎn)物5 | I l 在1 ．2 ％瓊脂糖凝膠

3、上電泳，用G o l d v i e w 標(biāo)記P C R 產(chǎn)物大小。P c R 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化( 上海桑尼生物科技有限公司膠純化回收試劑盒) ，以制備測序模板，采用S a n g e r 雙脫氧鏈終止法在A B l 3 7 3 0 x L 測序儀上進(jìn)行測序，用C h r o m a s 軟件和D N A M A N 軟件將測序結(jié)果與美國N C B I 基因庫所公布的F Ⅻ基因序列( G e n B a n kA F 5 3 8 6

4、9 1 ) 進(jìn)行比對( B l a s t e r ) ，尋找基因突變，如有發(fā)現(xiàn)突變則反向測序予以證實(shí)。結(jié)果一、遺傳性F Ⅻ缺陷癥家系凝血象檢測結(jié)果先證者及其胞弟A m 明顯延長，分別為A P T T 7 9 ．I s ／3 5 s 、A P T T 8 4 ．6 s ／3 5 s 。先證者大兒子A P l v r 稍高，為4 2 ．1 s ／3 5 s 。家系其他成員A P T T 正常范圍。先證者及其胞弟F X I 活性嚴(yán)重減低，分

5、別低至2 ％、3 ％，其F Ⅻ：A g 水平都< 1 ％；先證者胞兄及大兒子、小兒子F Ⅻ活性分別為3 9 ％、2 9 ％、3 4 ％，接近正常活性的一半。F Ⅻ：A g 水平分別為3 2 5 、3 0 ％、3 7 ％；小孫女F Ⅻ活性為7 1 ％，稍低于正常水平，F(xiàn) X H ：A g 活性為7 囅。該家系中FⅫ：c 缺陷患者同時(shí)伴隨F Ⅻ：A g 相應(yīng)下降，表現(xiàn)為交叉反應(yīng)物質(zhì)陰性。二、遺傳性F Ⅻ缺陷癥家系基因分析對該遺傳性F

6、Ⅻ缺陷癥家系成員所有1 4 個(gè)外顯子及側(cè)翼序列進(jìn)行P C R 擴(kuò)增，純化擴(kuò)增產(chǎn)物后，進(jìn)行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，先證者、其胞兄、胞弟、大兒子、小兒子、小孫女啟動(dòng)子區(qū)4 6 位多態(tài)性都為4 6 T ／T 型，侄女、大孫女、二孫女的啟動(dòng)子區(qū)4 6 位多態(tài)性為4 6 C ／T 型。另外先證者、其胞弟、大兒子、小兒子1 0 號外顯子7 1 4 2 位插入一個(gè)核苷酸C ( 7 1 4 2 i n s e r t C ) ，且均為7 1 4 2 i n s

7、 e r t C 雜合，使得3 4 6 位賴氨酸變成谷氨酸，即L y s ( K ) 一G 1 n ( Q ) ( K 3 4 6 Q ) ，該位點(diǎn)已于2 0 0 5 年國內(nèi)首報(bào)；另外，考慮到先證者、胞弟的極低F Ⅻ水平，而普通測序?qū)ζ渫怙@子5 + 6 的測序結(jié)果不理想，我們針對外顯子5- } - 6 進(jìn)行克隆測序。結(jié)果顯示：先證者、胞弟5 號外顯子5 7 4 1 - 5 7 4 2 位分別缺失堿基C和堿基A ，在正常對照組未發(fā)現(xiàn)此突變